HBx蛋白调控FOXO1基因CpG岛甲基化修饰致肝癌的分子机制研究

HBV感染与肝癌发生密切相关， HBx蛋白在HBV感染致肝癌的发生中发挥重要作用，但其具体作用机制尚未明了。HBV感染常伴随抑癌基因启动子CpG岛高甲基化现象，FOXO1作为一种关键的抑癌基因在肿瘤发生中起重要作用，那是否也在HBV感染影响下发生甲基化修饰致转录抑制，最终在肝癌的发生中发挥重要作用呢？生物信息学分析表明，人FOXO1基因启动子区存在CpG岛，即具有甲基化修饰的结构特征和基础；预实验证实HBx转染的HepG2细胞DNMT3a mRNA显著上调和FOXO1 mRNA显著下调。因此本项目拟以稳定表达HBx蛋白的HepG2为模型，采用染色质免疫沉淀技术、甲基化特异性PCR、亚硫酸盐基因组测序等技术研究HBx是否通过调控DNMTs表达或重分布使FOXO1基因启动子甲基化、转录抑制，导致增殖抑制基因转录下调从而在肝癌的发生中发挥重要作用，为HBV感染致肝癌的机制研究提供新的方向和思路。

本课题前期研究发现，HepG2等肝癌细胞株及HepG2-HBx细胞株中FOXO1启动子区均未见甲基化，且FOXO1 mRNA降解速率不受HBx影响。PCDH10是鼻咽癌、食道癌等肿瘤中发生甲基化修饰的重要抑癌基因。本课题前期研究证实，PCDH10基因在9/13 (69.2 %)肝细胞癌细胞株中表达沉默，PCDH10表达下调与其启动子甲基化状态有明显相关性。在此基础上，DNA甲基化酶抑制剂Aza可以部分去除PCDH10甲基化从而上调其mRNA表达水平。PCDH10在76 % (38 of 50) HCC肿瘤组织中甲基化，而对应的癌旁组织甲基化率仅40% (20/50)，正常组织中无甲基化。并且PCDH10甲基化程度与肿瘤大小、AFP含量和TNM分期相关（P<0.05）。但肝癌组织中HBV感染状态及HBx蛋白表达水平不影响PCDH10甲基化程度。 因此，PCDH10启动子异常甲基化使HepG2细胞内PCDH10基因转录沉默，但其甲基化状态与HBx蛋白表达无关。本课题后期研究发现，各种HCC细胞株和肝癌临床组织标本中HBX蛋白的表达水平并不影响FOXO1蛋白表达水平，但能影响多种miRNAs的表达水平：抑制miR-152表达而促进miR-221表达。为此，对本项目研究方案进行了适度调整，后续实验重在探讨HBX通过对miRNA的调控影响肝癌增殖的机制。研究结果表明，HBx在促进细胞增殖的同时增强miR-221表达而抑制ERα表达，抑制miR-221表达后可促进ERα表达而抑制HCC细胞增殖。Western blot证实，各种HCC细胞株和肝癌临床组织标本中ERα表达下调。虫荧光素酶活性实验证实ERα是miR-221的直接作用靶标。由此可见，HBx可能通过上调miR-221表达致ERα表达下调而促进HCC细胞增殖。另一方面，HBx抑制miR-152表达而促进Wnt1表达，增强miR-152表达能抑制Wnt1表达、并抑制HCC细胞增殖。虫荧光素酶活性实验证实Wnt1是miR-152的直接作用靶标。由此提示，HBx可能通过下调miR-152表达进而促进Wnt1表达而促进HCC细胞增殖。