猪瘟病毒p7蛋白在病毒颗粒装配和释放中的作用

Our previous results indicated that the 3′UTR is contributed to the reduced replication of genomic RNA and attenuation of CSFV, and that higher CSF-JE VRP titers were obtained from cell lines expressing the E2p7 than cell lines expressing only the E2. The purpose of our study is to investigate the role of the CSFV p7 protein in virus replication and assembly and release of infectious virions and virus pathogenicity. After functional sites of the p7 protein were determined by prediction and analysis of in vitro-expressed procusor E2-p7-NS2, a series of infectious cDNA clone mutants with mutagenized or deleted p7 were constructed based on an infectious CSFV cDNA clone. Virus mutants were rescued on PK15 cells for mutagenized p7 or on the trans-complementation for deleted p7. Efficiencies of the mutant replication, polyprotein processing and infectious virion assembly were investigated by detecting viral RNA, viral protein expression， such as Core, E2, NS2-3, NS3, and virus infectivity. The effect of p7 on viral protein-protein interaction and assembly complexes is further explored by confocal microscopy and co-immunoprecipitation. Charateristics and pathogenicity of p7 variants are studied on cells and in pigs. Our study may help in understanding the potential role of p7 in the CSFV life cycle and the mechanism of CSFV replication and virion assembly and could also be contributed to the development of new antiviral strategy.

前期研究证实，猪瘟病毒(CSFV)3′非编码区在决定病毒复制效率及减毒表型中起作用；E2缺失的非传播CSFV-JEV嵌合病毒显示减毒特性，其在表达E2p7比表达E2的互补细胞系上增殖滴度更高。在此基础上，拟开展p7蛋白在CSFV基因组复制、病毒颗粒装配与释放中的调控作用及机理研究。通过序列分析、功能预测和体外实验确定CSFV p7功能位点；基于全长感染性cDNA克隆构建p7缺失和位点突变的CSFV突变体，结合反式互补分析，测定病毒RNA、蛋白表达和病毒感染性，研究p7在CSFV复制、多聚蛋白加工和感染性病毒颗粒形成中的作用；应用荧光共聚焦和免疫共沉淀等技术研究p7与病毒蛋白的相互作用，探讨p7与病毒蛋白相互作用对病毒复制和病毒颗粒装配、释放的影响；猪体感染研究p7在机体致病性中的作用。这将有助于加深对CSFV基因组结构与功能、感染与致病机制的理解，为发展猪瘟防控新策略提供新的理论依据。

项目围绕计划任务目标开展研究，并对研究内容进行了适当扩展。经过四年的科学研究，在揭示猪瘟病毒P7的结构与功能、NS3的结构解析和创新反向遗传操作技术等方面取得了重要进展，完成了任务目标。.主要成果包括：①揭示了CSFV的编码蛋白P7与P7、P7与NS2、NS2与E2之间的相互作用关系及其对感染性CSFV产生的影响，P7和NS2直接相互作用的区域均位于第一个跨膜区；证实了P7的N末端在调节感染性CSFV产生中起关键作用。分析了P7蛋白的第18-23位的氨基酸(TDIENN)、第25位和第26位的YF、以及第30位Y等氨基酸在感染性CSFV产生发挥重要作用，其中P7/TDI181920AAA、P7/ENN212223AAA和P7/YFY252630AAA三氨基酸突变在影响感染性病产生中有协同效应；前体蛋白E2-P7是感染性CSFV产生非必需的，E2-P7的切割加工是病毒产生所必需的，但E2-P7中间体的存在有利于感染性CSFV的产生。②构建了利用RNA聚合酶I启动子驱动CSFV全长基因组感染性cDNA克隆，由CSFV基因组、其5′端的猪RNA聚合酶I启动子和3′端鼠RNA聚合酶I终止子构成；将其转染细胞直接转录病毒基因组RNA并拯救感染性CSFV，该技术的应用将极大地促进CSFV的基因组结构与功能研究和新疫苗研发。③经优化设计、采用大肠杆菌表达、亲和层析纯化制备了CSFV全长NS3蛋白，解析了2.4 Å 的NS3晶体结构；基于NS3的结构信息和CSFV反向遗传操作，发现了NS3参与调节CSFV基因组复制和感染性病毒形成的新机制。.这些工作扩展了我们对猪瘟病毒蛋白质结构与功能、复制调控和致病机制的理解，也为发展新型猪瘟基因工程疫苗提供新思路。