嵌合牛病毒性腹泻病毒基因的猪瘟疫苗C株重组病毒构建和特性研究

Based on the infectious cDNA clone of the CSFV vaccine strain C, the terminal untranslated region (3′UTR, 5′UTR), the antigenic glycoproteins (Erns, E2) and/or non-structure proteins (NS2-3, NS5B) genes of classical swine fever virus (CSFV) were replaced by the analogous sequence of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) to generate a series of chimeric CSFV/BVDV full-length DNA copies. The recombinant chimeric viruses were recovered from SK6 or PK15 cells transfected directly with the chimeric DNA copies. Growth, cell tropism, virulence, immunogenicity and genetic stability of the chimeric viruses were investigated both in cells in vitro and in infected pigs in vivo. Antibody response profiles induced by chimeric viruses in infected pigs were evaluated by ELISA assays. Chimeric CSFV/BVDV viruses with vaccine properties and serological markers of differentiation between infected and vaccinated animals (DIVA) were obtained. These studies are contributive to understand the structure and function of pestiviral genomes and to develop genetically modified DIVA vaccines for CSF prevention and eradication.

基于新发明的猪瘟疫苗C株感染性cDNA克隆高效病毒拯救技术平台(专利申请号：201510052888.8)，用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因组非编码区(3′UTR、5′UTR)、抗原蛋白(Erns、E2)和复制调控相关非结构蛋白(NS2-3、NS5B)单独替换或联合替换CSFV C株基因组对应区域，在猪源细胞系(SK6、PK15)上拯救、筛选重组嵌合病毒CSFV/BVDV，在细胞(体外)和机体(体内)水平研究各种重组嵌合病毒的生长特性、组织细胞嗜性、遗传稳定性和致病性及其分子基础；猪体接种研究重组病毒机体感染后体内的动态分布和分泌病毒能力，分析重组病毒接种诱导猪体免疫应答的水平和规律，筛选获得能在猪源细胞上高效增殖，对猪完全无毒力，不具有水平传播能力，能诱导猪体抵抗CSFV强毒株致死感染和携带血清学鉴别诊断标记的重组嵌合病毒，为发展用于猪瘟预防和根除的新型标记(DIVA)疫苗奠定基础。

猪瘟是严重危害我国养猪业健康发展的重大疫病之一。构建重组嵌合猪瘟病毒(CSFV)，研究重组病毒生物学特性，阐明病毒复制调控与致病性，为发展猪瘟标记疫苗提供理论依据，是猪瘟防控研究的重点方向之一。项目基于CSFV感染性克隆遗传操作，研究构建了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因组非编码区(UTRs)、E2和结构蛋白编码区替换CSFV对应区域的重组嵌合病毒CSFV/bUTRs，CSFV/bE2、CSFV/btE2、CSFV/btE2/UTRs和CSFV/bC-E2，研究了其感染与复制能力、细胞嗜性及遗传稳定性等特性。研究结果证实，非编码区替换对重组病毒感染性、细胞复制、形成嗜斑能力和遗传稳定性不产生影响；全长或截短E2基因替换影响重组病毒细胞嗜性、形成蚀斑能力和复制效率；牛病毒性腹泻病毒(BVDV)结构蛋白编码区CErnsE1E2(C-E2)序列替换的重组病毒CSFV/bC-E2失去感染PK15细胞能力，能低效率感染MDBK细胞，但不能在细胞上持续传代。动物实验初步证实，重组病毒CSFV/bE2兔体诱导鉴别诊断抗体应答，后续猪体研究有望获得预期结果。这些结果为进一步理解瘟病毒基因组复制调控、病毒遗传变异规律和发展新型标记猪瘟疫苗提供了重要的理论依据。