猪瘟病毒NS5A蛋白在病毒致病中的作用及机制

猪瘟病毒（CSFV）NS5A蛋白对CSFV的复制必不可少，但NS5A蛋白对宿主细胞有何影响并不清楚。我们首次发现CSFV NS5A蛋白在猪血管内皮细胞中表达可引起细胞内活性氧（ROS）和X盒结合蛋白1（XBP1）的水平明显升高，提示NS5A蛋白可能在刺激细胞发生氧化应激(OS)和未折叠蛋白反应(UPR)中起着重要的作用。本项目将 NS5A基因转入猪血管内皮细胞中进行表达，确定其亚细胞定位，确证该蛋白影响猪血管内皮细胞发生0S和UPR的作用及分子途径，用反向遗传技术结合基因缺失和定点突变查明NS5A蛋白中触发OS和UPR的主要功能区和关键位点，用酵母双杂交技术寻找与NS5A蛋白发生相互作用的胞内蛋白，并通过RNA干扰等方法进一步明确其在NS5A蛋白对细胞功能影响中的作用及参与细胞内信号转导的途径，为揭示NS5A蛋白在猪瘟病毒致病中的作用及其机制提供新的科学依据。

猪瘟病毒（CSFV）NS5A蛋白为病毒复制所必须，但其对宿主细胞有何影响并不清楚。研究发现CSFV NS5A蛋白在猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）中表达可引起细胞内活性氧（ROS）和X盒结合蛋白1（XBP1）的表达量明显增高，提示NS5A蛋白可能在刺激细胞发生氧化应激（OS）和未折叠蛋白反应（UPR）中起着重要的作用。在SUVEC中进行NS5A蛋白的表达，确定其亚细胞定位及影响细胞发生OS和UPR的作用及分子途径；用反向遗传技术结合基因缺失和定点突变技术，查明NS5A蛋白中触发OS和UPR的主要功能区和关键位点、对细胞功能的影响及参与细胞内信号转导的途径；用酵母双杂交技术筛选与NS5A蛋白发生相互作用的胞内蛋白，采用过表达和shRNA敲低/抑制方法研究部分互作蛋白在CSFV病毒增殖中的作用。结果表明，NS5A蛋白中缺少信号肽序列，在226-247位氨基酸之间可能存在膜结合区域；NS5A蛋白亚定位于SUVEC的内质网上，并能诱导细胞产生大量的ROS，进而诱发内质网应激，激活细胞中的UPR信号通路；CSFV及NS5A蛋白诱发UPR主要是通过激活UPR信号通路中ATF6及IRE1途径实现的；NS5A蛋白N端的1-84为核苷酸与其在内质网上的特异性分布有关，1-804位核苷酸与NS5A引起的OS有关；NS5A蛋白在S15、S92及T401位点的磷酸化可能导致细胞中氧化应激水平的下降，第81位丝氨酸和401位苏氨酸是其激活UPR通路的关键氨基酸位点。通过酵母双杂交试验寻找到了19个可能与NS5A蛋白互作的胞内蛋白，确证HSP70、DDX5和FKBP8可以与NS5A发生互作，并对CSFV复制都起到促进作用。本项目还根据需要增加的一些研究结果表明，CSFV及其p7蛋白能够诱导细胞IL-1β的表达，CSFV的感染与增殖需要整合素β3的存在，CSFV能引起感染细胞中血管内皮生长因子C（VEGF-C）表达的升高。本项目揭示了CSFV NS5A蛋白与宿主细胞间的相互关系，为阐明NS5A在病毒致病过程中的作用及机制提供了科学资料。