新型脑苷脂类免疫抑制剂cerebroside D和fusaruside的合成生物学研究

Immunosuppressors are drugs that prevent the rejection of transplanted organs and treat autoimmune diseases. Many immunosuppressive drugs have side-effect because of their non-selectivity, thus novel immunosuppressants with high-selectivity are urgently needed. Recent research indicated that cerebroside D and fusaruside can selectively inhibit the STAT1 signaling way in T cells, providing new clues for the development of immunosuppressive drugs. However, this kind of compounds is rare in microorganisms, and difficult to obtain by chemical synthesis, prohibiting their in-depth pharmacological investigation. Recently, the biosynthetic pathways of these compounds have been illuminated by gene knockout and heterologous expression. In this foundation, we will further into: (1) Reestablishment the biosynthetic pathways of the cerebrosides in engineered Pichia pastoris using genes co-expression technology. (2) Improvement the production of the cerebrosides by replacing strong promoter and optimizing culture condition. In conclusion, this research will allow the desired large scale production of this kind of new immunosuppressant sources.

免疫抑制剂是治疗移植排斥和自身免疫系统疾病的药物，但是常存在多种副作用，因此，急需寻找针对治疗靶点的高选择性新型免疫抑制剂。近期的研究表明，一类脑苷脂类化合物cerebroside D及其类似物fusaruside，可选择性抑制原代T细胞STAT1的活化，为新型免疫抑制剂的开发提供了研究思路。但是，这类化合物在微生物中含量极少，且难以通过化学合成得到足够的量，严重制约了其深入的药理研究。前期我们已通过基因敲除、异源表达等手段阐明了这类化合物的生物合成途径，在此基础上，本项目拟：（1）利用多基因串联共表达技术，在毕赤酵母中重建这类化合物的生物合成途径，获得工程菌株；（2）通过替换强启动子和培养条件优化等手段，进一步提高其产量。通过上述方法，为这类新型免疫抑制剂建立一条绿色高效的工业化生产途径。

免疫抑制剂是治疗移植排斥反应和自身免疫疾病的主要药物。但是，目前临床常用的免疫抑制剂存在多种不良反应，这多与免疫抑制药物对靶点的选择性不高有关。近期研究表明，天然小分子化合物fusaruside具有良好的选择性免疫抑制作用，可选择性作用于STAT1信号通路，靶向效果较好，是极具潜力的临床用免疫抑制分子。然而，fusaruside是丝状真菌镰刀菌属Fusarium sp.的细胞构成物，在微生物中的含量甚微，且结构复杂、难以通过化学合成得到，这些因素严重制约了其深入的药理研究。本研究在已知fusaruside生物合成途径的基础上，利用合成生物学技术，采用可自我剪切的2A肽序列，在毕赤酵母中共表达fusaruside生物合成相关酶（3位去饱和酶，10位去饱和酶），重建fusaruside的生物合成途径，获得了可以生产该化合物的重组酵母菌株，命名为FUS2。为进一步提高产量，构建了三酶（3位去饱和酶，10位去饱和酶，葡萄糖神经酰胺合成酶）共表达毕赤酵母工程菌菌株FUS3，并优化了该酵母菌的培养和诱导条件（包括pH值、培养温度、甲醇诱导浓度等）。与原产菌株Fusarium sp.相比，毕赤酵母具有生长迅速、遗传操作容易、后期处理简单等多方面的优点。本研究的成果有利于实现对fusaruside规模化、程序化的制备，为fusaruside的进一步开发与应用奠定了基础。