基于连续相变形光栅的实时多彩三维生物显微成像的研究

One of the main challenges in modern biological research is three-dimensional (3D) imaging of living specimens. Classical microscopy methods – such as widefield microscopy and confocal microscopy – all record 2D image planes, which are limited in 3D imaging and tracking of living cells and proteins. Some previous studies have shown that distorted diffraction grating enables simultaneous imaging of multiple object planes with a single camera, and can be used to real-time there-dimensional biological microscopic imaging system. But there are some shortages of the conventional distorted gratings, such as the energy distribution among the diffraction orders is not uniform, total diffraction efficiency is low (about 50%), and the diffraction angle from the grating is dependent on wavelength and with broadband illumination transverse dispersion leads to chromatic blurring of the images in the non-zero orders. Hence, a distorted continuous phase grating is developed for 3D microscopic imaging of living biological samples. The energy distribution among the setting diffraction orders of this new grating is uniform, and the diffraction efficiency is increased (to above 90%). The chromatic dispersion, introduced by the distorted grating, will be corrected by a designed chromatic correction grating. Furthermore, the diffraction efficiency of the continuous phase gratings can be improved by more complex structures. And the 3D microscopy with distorted continuous phase grating and chromatic correction grating will allow real-time multicolor 3D imaging and been applied to study biological specimens ranging from single molecules inside cells nuclei to entire cells.

快速、多色彩的活生物样品实时三维显微成像是现代生物研究的最主要挑战之一，已有的宽场显微镜、激光共聚焦显微镜等仅能获得样品的二维光学信息，限制了细胞、蛋白等生物样品的三维跟踪与测定研究。多项前期研究表明变形光栅的衍射效应可以实现对样品的多个层面进行同时成像，能够发展出一种真正意义上的实时三维成像技术。但是目前已有的变形光栅存在各衍射能级光强差异大、总体衍射效率较低（约为50%）、复色光入射产生色散等固有缺陷，严重限制了变形光栅三维成像的发展。本项目拟在已有研究的基础上，进一步研究连续相变形光栅的三维成像，以实现各衍射能级光强分布均匀、衍射效率高（高于90%），并消除复色光造成的衍射色散等问题，重点评估连续相变形光栅形状与衍射效率的关系，分析彩色校正光栅对衍射光色散的校正作用。并以优化的连续相变形光栅发展出一种用于活生物样品检测的实时多彩三维光学显微成像系统，为生物医学研究提供新的科学工具。

现代生物学研究的一个主要挑战是活细胞的实时三维动态成像，实时三维动态成像技术对各种生物过程的三维观察与生物分子的实时跟踪、测定具有极其重要的意义，因此近年来实时三维成研究成为生物物理领域的一个重要课题。变形光栅技术被认为是实现三维显微成像和检测的一种理想方案，但目前研究采用的二元相变形光栅技术存在衍射效率低、均匀度差等问题。本项目采用基于连续相变形光栅理论的多相位衍射光栅技术，其具有8个乃至更多的相位，根据衍射光栅成像理论，可以通过傅里叶变换与点扩散函数分析衍射光栅的衍射效率并寻找到最优的衍射光栅图案。通过数值仿真研究发现，具有最优衍射效果的多相位光栅的衍射效率可以达到85%-95%，远高于二元相光栅的最高衍射效率（67%），且具有较好的均匀度，因此其可以作为构建三维成像系统的基础。新型多相位光栅可以通过相位叠加刻蚀的方法进行光栅刻蚀，目前已经实现8相位的变形光栅刻蚀，刻蚀出的9层与25层成像光栅的衍射效率可达到约83%和81%。基于该变形光栅本项目研究搭建了一套三维生物成像系统，并通过测量聚苯乙烯微球表明搭建的三维成像系统具有较好的Z轴分辨率。通过采用该三维成像系统对花粉孢子、酵母细胞、HeLa细胞、秀丽隐杆线虫等多种生物进行了实时三维成像，结果表明项目研究的三维成像系统可以在低亮度条件下对各种类型的生物样品进行三维、实时、动态成像，并可采用软件对同时拍摄出的9张或25张二维图像进行三维重构。本项目研究结果表明搭建的三维成像系统对生物样品进行实时三维成像时同时具有较好的时间和空间分辨精度，可以进行低光照、多种样品尺寸条件下生物样品进行三维监测。而且随着光刻技术的发展，更多相位、更高精度的多相位光栅刻蚀的实现，可以发展出更高精度、更好性能的三维生物成像系统，成为未来生物学、医学研究的有力工具。