基于转录组的维药新塔花黄酮类成分生物合成途径研究及功能基因发掘

Ziziphora bungena Juz. is one of the species in the genus Ziziphora L. of the family Lamiaceae, the aerial part or the whole herb has been commonly used for the treatment of myocardial ischemia in Uygur and Kazak. Previous studies showed the accumulations of Z. bungena flavonoids, which are the main active substances, are directly related to the expression levels of the flavonoid biosynthesis genes. Therefore, this project will use high-throughput sequencing techniques and some methods in bioinformatics, chemical analysis and molecular biological area, explore the relationship between the change of Z. bungena flavonoids and the differential expression of flavonoid biosynthesis related genes, and predicate the biosynthesis pathways of Z. bungena flavonoids. The project will also screening, cloning and constructing the prokaryotic or eukaryotic expression vector for some of the key enzyme genes in Z. bungena flavonoid biosynthesis pathway, and validate the expression products, to provide the practical evidence for the biosynthetic pathway and accumulation mechanism of flavonoid components of Z. bungena. The key environmental factors and genes regulating the biosynthesis of flavonoids will be analyzed by the study on the expression difference of functional genes under various stress and hormone treatments. This project will be useful for the synthetic biology study on the main anti-myocardial ischemia components, Z. bungena flavonoids, and can provide theory basis on studies related to the cultivation of Z. bungena.

新塔花Ziziphora bungena Juz.为唇形科塔花属植物，其地上部分或全草是新疆维吾尔医及哈萨克医常用药材，主要用于治疗心肌缺血等疾病。前期试验表明：新塔花不同部位黄酮类药效物质的积累与其生物合成途径相关基因的差异表达直接相关。因此，本项目拟利用转录组高通量测序技术、生物信息学方法、化学分析方法和分子生物学方法，探索新塔花黄酮类成分变化与黄酮类生物合成相关基因的差异表达之间的联系，预测其黄酮类成分生物合成途径。本项目还拟筛选、克隆、构建关键酶基因的原核或真核表达载体，进行表达验证，为新塔花黄酮类药效成分的生物合成与积累途径提供分子层面切实证据。并通过分析不同逆境、激素条件下黄酮类成分生物合成途径中功能基因表达差异，推测调控其黄酮类生物合成的关键环境条件与相关基因。本项目能够为将来新塔花抗心肌缺血黄酮类药效成分的合成生物学提供研究基础，也能够为新塔花栽培相关研究提供理论依据。

新塔花（Ziziphorae herba）是新疆地产的中药、民族药药材，具有强心利湿，理气化痰，消炎散结之功效；主要用于心脏病，感冒发热，心悸失眠等。研究开展新塔花的黄酮类等成分研究、生物合成途径、关键基因的克隆和表达验证等系统的研究工作。.1.通过HPLC-MS/MS对新塔花组织特异性成分的研究，阐释了新塔花地上部分替代其全草的成分依据。对新塔花根、茎、叶、花、果实不同部位的总黄酮提取物进行了分析测试，共鉴别出43种成分，包括黄酮类29种，酚酸类12种，其它类2种，其中22种是首次在新塔花中发现。这些成分的发现为今后新塔花中有效成分的分离纯化提供了参考；通过PCA分析和方差分析，筛选出9种特征成分，可有效区分新塔花4个不同药用部位，为其药效部位的精准应用提供了质控手段；.2.结合新塔花黄酮类成分的代谢组和网络药理学、细胞实验等研究，初步探索了新塔花总黄酮具有多成分（7个成分）-多靶点（12个靶点）-多通路（72条通路）的抗心肌缺血作用机制。蒙花苷通过在胃肠内水解为金合欢素，金合欢素主要通过花生四烯酸炎症反应代谢通路（Arachidonic acid metabolism：ACM）对心肌组织有保护作用。.3.通过对新塔花转录组高通量Illumina测序和SMRT转录组分析，建立了新塔花转录组及差异表达的研究平台，获得了其主要黄酮类成分的生物合成途径。分析获得了397,182个unigenes，筛选、克隆并获得了14个新塔花黄酮类成分生物合成途径的关键酶cDNA全长。结合组织特异性qPCR和其代谢组数据，获得了12个主要黄酮类化合物的生物合成途径；进一步分析发现新塔花中蒙花苷可能是通过芹菜素-7-O-芸香糖苷加甲氧基合成的，这与野菊Chrysanthemum indicum L.略有不同，表明了植物次生代谢物生物合成的物种多样性。.4.构建了新塔花Zb4CL1、Zb4CL2、Zb4CL3的原核表达系统，并在重组大肠杆菌中成功表达。体外催化实验发现，Zb4CL1可催化芥子酸的反应、Zb4CL3可催化咖啡酸的反应，这与之前的报道不同，一定程度上说明了4CL家族功能的多样性。这也为其真核表达系统的构建及相关的功能验证奠定了基础。