癌相关分子CD147启动子主动去甲基化的分子机制及靶向逆转研究

Aberrant methylation plays an important role in the cancer initiation and development. Promoter hypomethylation of cancer related molecule CD147 could upregulate its expression and promote cancer metastasis, but the mechanism of the hypomethylation remains unknown. The TET/TDG mediated base excision repair is a key mechanism of active DNA demethylation, which is regulated by TGF-β. Our preliminary study suggested that active DNA demethylation is the main reason of CD147 promoter hypomethylation. In order to elucidate the molecular mechanism of the active demethylation of CD147 promoter, we will explore the interation between the transcription factors Sp1, c-Myc, Ap1, KLFs, TGF-β/SMAD and the key enzymes of active demethylation TET, AID, TDG using ChIp, bisufite sequencing and protein interation analysis methods. Then we will use the CD147 promoter specific TALE-DNMT fusion protein for targeted reversing its hypomethylation status to down-regulate CD147 expression, and detect the influence on hepatocellular carcinoma invasion and metastasis in vitro and in vivo. Through investigating the mechanism of CD147 promoter active demethylation and targeted reversing with TALE-DNMT will contribute to fully understand the cancer epigenetic regulation mechanism and promote the development of cancer epigenetic therapy.

DNA甲基化调控异常在肿瘤发生发展中发挥重要作用。本课题组前期工作证实癌相关分子CD147启动子低甲基化上调其表达并促进肿瘤转移，但其低甲基化机制尚不明确。目前认为TET/TDG诱导的碱基切除修复是主动去甲基化的关键机制，这一过程受TGF-β信号调控。我们的初步研究提示主动去甲基化是CD147启动子低甲基化的主要原因。为此，我们拟通过ChIP、亚硫酸盐测序、蛋白相互作用分析等方法，探索Sp1、c-Myc、Ap1、KLFs、TGF-β/SMAD等转录因子与TET、AID、TDG等主动去甲基化关键酶的相互作用及共同参与主动去甲基化的机制，并创新性的应用CD147启动子特异性TALE-DNMT融合蛋白靶向性逆转其低甲基化进而下调基因表达，从体外、体内检测对肝癌侵袭转移的影响。研究CD147启动子主动去甲基化机制并进行靶向性逆转，将有助于全面认识肿瘤表观遗传调控机制，推动肿瘤表观遗传治疗的发展。

DNA甲基化调控异常在肿瘤发生发展中发挥重要作用。本课题组前期工作证实癌相关分子CD147启动子低甲基化上调其表达并促进肿瘤转移，但其低甲基化机制尚不明确。目前认为TET/TDG诱导的碱基切除修复是主动去甲基化的关键机制，这一过程受TGF-β信号调控。本课题通过ChIP、亚硫酸盐测序、蛋白相互作用分析等方法，揭示Sp1、c-Myc、Ap1、KLFs、TGF-β/SMAD等转录因子与TET、AID、TDG等主动去甲基化关键酶的相互作用及共同参与主动去甲基化的机制，并应用CD147启动子特异性TALE-DNMT融合蛋白靶向性逆转其低甲基化进而下调基因表达，从体外、体内检测对肝癌侵袭转移的影响。本课题发现转录因子KLF6对CD147启动子区的结合及转录阻遏作用以及对Sp1自我转录激活的负调控作用，揭示CD147新转录调控分子。KLF6可以显著抑制肝癌细胞的侵袭和转移。随后运用深度测序发现在正常和肿瘤组织中，甲基化程度发生变化，相对于正常组织在肿瘤组织中5mC水平降低，5hmC水平升高。ChIP-seq揭示，5mC和5hmC都可以特异性的结合到CD147启动子区，当CD147高表达时5hmC结合增多，5mC结合减少，随着甲基化程度的降低CD147表达会增高。转录因子KLF6会募集MECP2和DNMT到CD147启动子区下调基因表达。TGF-β通过募集去甲基红酶TDG、Sp1到CD147启动子区上调基因表达。TGF-β上调CD147表达需要TDG的结合。设计了靶向CD147的TALE-DNMT载体，可以靶向逆转CD147表达。本课题研究CD147启动子主动去甲基化机制并进行靶向性逆转，将有助于全面认识肿瘤表观遗传调控机制，推动肿瘤表观遗传治疗的发展。