一种倍半萜的代谢工程对植物类异戊二烯途径及生长发育特性的影响

Terpenoids are a kind of main secondary metabolites in plants, and closely related to plant growth and the adaptation to the environment. Metabolic engineering has been one of the most potential technologies to study the metabolism and regulation of terpenoids. α-Farnesene synthase(α-AFS) is the last enzyme in the synthesis of sesquiterpene α-farnenese. CaMV35S-AFS gene was first transformed into tobacco, and we got markedly phenotype in height and flowering time of transgenic plant homozygotes. In this research, Rubisco-AFS、Rubisco-plasmid/mitochondria targeting-AFS fusion gene expression vector will be constructed to overexpress α-AFS gene in cytosol, plasmid and mitochondria of tobacco cells, respectively, and the effects of main enzymes expression and terpenes metabolism profile included α-farnesene in the isoprenoids pathway will be investigated. The aim is to further study the effects of α-farnesene metabolism engineering on the isoprenoid metabolic network and the plant growth and development traits, and to explain the importance of the terpenoids metabolism in plants life.

萜类物质是植物中一类主要的次生代谢物，其与生长发育和对环境适应密切相关。萜类代谢工程已成为研究萜类代谢及其调控的新手段。α-法尼烯合酶（α-AFS）是催化倍半萜α-法尼烯合成的最终酶，课题组将CaMV35S-AFS基因进行转化获得了株高和花期等表型具有显著差异的转基因烟草纯合体。本项目拟在此基础上，通过构建Rubisco-AFS、Rubisco-plasmid/mitochondria targeting-AFS融合基因表达载体，首次将α-AFS基因分别在烟草细胞的胞质、质体和线粒体中定位超量表达，研究其对类异戊二烯途径中相关酶基因表达和含α-法尼烯在内的萜类代谢网络中产物丰度的影响，进一步探讨α-法尼烯代谢工程对类异戊二烯代谢网络，植物生长发育特性的影响及分子机制，解释萜类物质代谢在植物生命活动中的重要作用。

α-法尼烯是一种挥发性倍半萜烯，由MVA途径α-法尼烯合酶催化生成。本研究首次通过将苹果α-法尼烯合酶基因（MdAFS）在烟草和拟南芥的细胞质、叶绿体和线粒体过表达，研究了其对烟草和拟南芥萜类代谢的调控和挥发物产物释放以及转基因植株生长发育的影响。主要结果如下：.MdAFS表达受非生物因素机械损伤，MeJA，GA，SA, ETH，温度，干旱和氧化胁迫诱导，且具有昼夜节律性，构建了MdAFS细胞质、叶绿体和线粒体真核表达载体并转化拟南芥和烟草。GC-MS分析表明，转基因拟南芥花中挥发物含量明显提高，叶中产生了D-柠檬烯和香叶基丙酮两种新萜类，在胞质（f1）和叶绿体（P3）定位植株中检测到α-法尼烯，而在线粒体（M2）植株中检测到倍半萜β-石竹烯。与光合有关的萜类叶绿素和类胡萝卜素含量均高于野生型，但是甾醇含量明显比野生型拟南芥含量低。过表达MdAFS影响了莲座期和盛花期萜类代谢MVA和MEP途径相关基因AtAACT2、AtIPI1、AtHMGR1和AtDXS的表达；定位过表达MdAFS后明显降低了烟草单萜含量，提高了倍半萜、叶绿素、类胡萝卜素、脱落酸含量，而赤霉素含量变化不明显，并改变了萜类代谢途径相关基因的表达。此外，在转基因株系中意外发现有部分雄性不育植株，利用TAIL-PCR的方法克隆得到了两个NtR1-A-like和NtMLP423新基因，并对该两个基因的功能进行了研究，首次发现它们与植物的抗性有密切的关系。.在胞质中过表达烟草植株中出现早衰表型，植株中活性氧积累，抗氧化酶活性和抗氧化物质含量显著下降。转基因植株净光合速率、淀粉和可溶性糖含量显著下降、且茉莉酸、水杨酸水平下降、乙烯释放速率降低，而油菜素内脂含量显著增加，细胞分裂素含量无明显变化。转录组分析表明，与抗氧化相关、类胡萝卜素代谢、质体醌代谢、抗坏血酸盐代谢和氮代谢发生明显变化，qRT-PCR验证显示萜类合成途径关键基因HMGR1、HMGR2和HMGS上调表达而DXS、DXR、IDI、FPPS和GPPS下调表达。施用钾离子处理后，GC-MS分析过表达烟草花中检测有少量法尼烯释放，并且增加了其它萜类物质的释放。本研究表明过表达MdAFS影响了植物萜类代谢和生长发育。