α-法尼烯合成途径中关键酶基因启动子的克隆、表达分析及重要调控元件的鉴定

已知倍半萜类物质α-法尼烯与植物的抗冷性、昆虫诱导及冷藏苹果和梨果实重大的生理病害－虎皮病的发生有关。3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)和α-法尼烯合成酶（α-FS）是α-法尼烯合成途径中的两个关键酶。本研究利用TAIL-PCR 法分离不同苹果品种HMGR和α-FS基因启动子序列，并进行序列分析和功能预测，利用启动子全长和5′端系列缺失及定点突变片段与报告基因构建表达载体，转化烟草，探讨温度、乙烯等因素对启动子的调控机制，确定主要顺式作用元件位置；将确定的诱导型启动子和CaMV35S启动子分别与HMGR和α-FS基因cDNA构建表达载体转化番茄，研究其在不同组织器官和发育阶段表达情况，以及对转基因植株挥发物组分及含量的影响，由此进一步了解α-法尼烯合成途径中的调节位点和调控机制，从分子水平研究α-法尼烯与虎皮病发生的相关性，以更好调节α-法尼烯的合成，控制虎皮病的发生。

α-法尼烯合酶（α-FS）是α-法尼烯合成途径中的最终酶。HMGR是萜类合成中的甲羟戊酸代谢途径的第一个限速酶，它催化HMG-CoA形成MVA，是细胞质萜类代谢中的重要调控位点。本课题对苹果的α-FS和HMGR基因的表达模式和启动子功能进行了研究，主要结果如下：.（1）利用TAIL-PCR方法从青香蕉苹果中克隆了α-AFS基因启动子序列，该序列具有明显的TATA框和CAAT框及与激素相关元件，在ATG下游分别有一个参与热胁迫反应的HSE元件和厌氧诱导的ARE元件等重要顺式作用元件。研究表明GA、MeJA、乙烯利处理增强了该启动子活性，而SA和ABA处理则相反。.（2）研究了苹果HMGR基因家族的MdHMGR1-3三个基因的组织表达模式及诱导表达模式，虽然在苹果嫩叶、老叶、茎、根及果实中均有表达，但表达模式有很大不同，且在ABA、ETH、GA、IAA、MeJA及SA处理下的诱导表达模式也有很大差异；克隆并获得了苹果HMGR基因家族的启动子序列，并通过HMGR启动子驱动的GUS基因在转基因拟南芥中的时空表达模式及诱导表达模式确定了苹果HMGR基因表达的组织特异性及诱导因素；通过缺失分析鉴定HMGR启动子不同区域的功能，发现该启动子的表达具有时间和组织部位的特异性，且MdHMGR2启动子片段-1050至-827对该启动子维持高水平的活性具有重要作用。.（3）首先发现了与MdHMGR1基因同源性高达97.04%的MdHMGR1-like基因。分析发现，MdHMGR1-like基因在根中表达水平远高于其它组织且受ETH、MeJA及SA显著诱导。进一步扩增得到了MdHMGR1及MdHMGR1-like启动子，二者序列比对发现，其同源性为49.21%。将MdHMGR1及MdHMGR1-like启动子分别转化拟南芥，发现MdHMGR1启动子驱动GUS基因在拟南芥呈高水平组成型表达，而MdHMGR1-like启动子驱动GUS基因表现为根组织特异性表达。.（4）构建了含pCaMV35S启动子的组成型表达载体pBI121-35S-HMGR1和含HMGR1自身启动子pHMGR1的诱导型表达载体转化番茄，发现转基因果实体积大但易裂果。.本课题通过研究苹果α-FS和HMGR启动子的结构和功能，为了解萜类合成途径的代谢调控及探讨如何利用代谢工程及基因工程等获得有用的萜类化合物具有重要意义。