苹果α-法尼烯合成酶基因克隆、表达载体构建及遗传转化研究

α-法尼烯是一种存在于植物体中的倍半萜类物质，已知与植物的抗冷性、昆虫的诱导及冷藏苹果和梨果实重大的生理病害－虎皮病的发生有关。α-法尼烯合成酶是调控α-法尼烯合成最直接的一个酶。利用RT-PCR方法从苹果果皮中克隆得到α-法尼烯合成酶基因；构建α-法尼烯合成酶基因的正义及RNAi表达载体；利用农杆菌介导法转化苹果、梨和番茄，得到转基因植株；进行转基因植株的检测，包括Southern杂交和Northern杂交检测，以及构建α-法尼烯合成酶基因的原核表达载体，进行该酶的体外表达，纯化蛋白，制备抗体，进行Western检测；研究转基因植株有关生理特性，探讨α-法尼烯与高温逆境的关系；GC-MS法测定对照和转基因植株包括α-法尼烯在内的挥发物含量变化。本研究为进一步获得转基因苹果果实，探讨虎皮病的发生分子机制和根本原因，获得抗虎皮病的品系奠定基础，具有重要的科学意义和应用价值。

α-法尼烯是一种存在于植物体中的倍半萜类物质，已知与植物的抗冷性、昆虫的诱导及冷藏苹果和梨果实重大的生理病害－虎皮病的发生有关。α-法尼烯合成酶是调控α-法尼烯合成最直接的一个酶。利用RT-PCR方法从苹果果皮中克隆得到α-法尼烯合酶基因；构建了α-法尼烯合酶基因的正义/反义及RNAi表达载体；利用农杆菌介导法转化了丰产梨、番茄和烟草，在国际上首次获得了得到了丰产梨、番茄和烟草转基因植株；进行了转基因植株的检测，包括Southern杂交和Northern杂交检测，以及构建α-法尼烯合酶基因的原核表达载体，进行该酶的体外表达，纯化蛋白，制备抗体，进行Western检测；研究了转基因烟草、番茄和果树苗植株生理特性和分子基础，尤其在国际上首次发现转α-法尼烯合酶基因的烟草植株的花期比野生型提早50天，与转基因番茄和转基因梨苗一样具有较高耐热性，表现在在高温下维持较高光合能力。经HPLC法和GC-MS法检测发现对照和转基因植株的萜类物质有较大差异，尤其在转基因烟草中发现二萜GA和倍半萜ABA含量显著增加，IAA含量也显著增高，与萜类代谢有关的甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸途径的关键酶HMGR，FDP和DXR等基因的表达明显提高，尤其与GA合成代谢有关的基因显著上调；α-法尼烯合酶基因的过量表达显著上调了与开花有关的基因NtMADS4 and NtMADS11。本研究进一步证实了类异戊二烯途径间存在IPP交流萜类，为研究萜类物质的代谢工程提供了新的研究思路，并为进一步获得转基因果实，探讨虎皮病的发生分子机制和根本原因，获得抗虎皮病的品系奠定基础，具有重要的科学意义和应用价值。