亚种杂交影响小鼠记忆T细胞形成的分子机制

Memory T cells are essential for the adaptive immune system, which confers long-term protection eliminating infections and cancer, and are also the basis for efficacious vaccination. However, the mechanisms governing memory T cell formation and the maintenance of quantity and function of these cells remain incompletely understood. In this proposed study, we apply a genetic model originating from inter-sub-specific crosses between two mouse strains with extensive genetic divergence, to uncover the molecular interactions critical for the differentiation and maintenance of memory T cell. We found that the inter-sub-specific crosses significantly affect the memory T cells compartment. Such a strategy based on inter-sub-specific crosses is important for dissection of genetic interactions, and we cross M.m.domesticus derived C57BL/6 mice to PWD/PhJ mice which are from a distantly related sub-species M.m.musculus to obtain hybrids. The hybrids are further backcrossed to C57BL/6 in order to generate N2 mice that are analyzed for memory T cell using flow cytometric parameters such as CD44 and CD62L expression of CD4 T cell in the spleenocytes. In parallel, we will perform linkage analysis based on the genome wide scanning of genetic markers, to identify genes and genetic interactions underlying the phenotypic differences in the N2 mice. To elucidate such molecular mechanisms is fundamental for therapies against T cell related inflammation and cancer, and it is also of great interest for livestock breeding.

记忆T细胞对获得性免疫至关重要，它是机体有效清除感染和肿瘤的基础，也是接种疫苗获得免疫保护的基础。记忆T细胞的产生、功能与数量维持的分子机制十分复杂，仍有待深入研究。本课题利用亚种杂交、将遗传分化程度极高的基因组混合，构建基因互作模型以探索影响记忆T细胞形成的机制。申请人已发现不同亚种来源的C57BL/6（M.m.domesticus）与PWD/PhJ（M.m.musculus）小鼠杂交回交后，N2代小鼠记忆T细胞形成因亚种间基因相互作用受到严重影响。亚种杂交是揭示基因相互作用机制的重要研究策略，本课题将C57BL/6与PWD/PhJ小鼠杂交，获得回交群体。FACS检测其脾脏CD4 T细胞CD44,CD62L表达，明确记忆T细胞数量；并用全基因组遗传位标扫描、连锁分析，明确影响小鼠记忆T细胞形成的分子遗传机制。明确此机制对理解T细胞相关炎症、肿瘤发生及动物遗传育种具有重要意义。

近交系小鼠是一种巨大的遗传资源库，通过它可以阐明哺乳动物的病理生理学相关问题，长久以来，科学家都希望通过近交系小鼠之间的遗传差异来鉴定出导致近交系小鼠之间表型差异的致病基因。野生来源的小鼠品系具有在数十万年的进化中获得的巨大遗传变异。然而，在CRISPR / Cas9基因组编辑工具系统出现之前，验证非经典品系中的遗传变异是不可行的。在本研究中，我们首先在野生来源的PWD / PhJ亲本小鼠和其与C57BL / 6（B6）小鼠杂交获得的子代F1小鼠中发现了T细胞相关表型，在随后的试验中，我们使用遗传连锁作图和染色体替换系小鼠在2号染色体上获得一个控制此性状的遗传位点，更重要的是，我们通过等位基因特异性敲除的方法（即通过特异性打靶，仅破坏来自于PWD的Cd44基因拷贝，而保持来自于B6的Cd44基因拷贝完全完整）验证了控制T细胞表型的基因功能。在具有显性表型的F1小鼠中，通过设计，寻找获得了仅靶向PWD基因组DNA的sgRNA PAM序列，从而实现PWD来源的等位基因特异性敲除，以此来快速验证候选基因功能。我们使用来自于PWD小鼠的精子细胞为来自于B6小鼠的卵细胞进行受精获得受精卵细胞，通过显微注射系统将CRISPR / Cas9基因打靶成分注射入受精卵细胞，移植假孕小鼠以后，共获得10只F1小鼠。在新出生的10只F1小鼠中，经过检测，发现80％（n = 10）小鼠特异性地敲除了PWD来源的Cd44等位基因，所有小鼠中B6来源的Cd44等位基因都没有发生剪切。进一步，在得到的等位基因特异性敲除的F1小鼠中，我们观察到T细胞表型已经完全恢复。因此，我们的研究为验证基因功能提供了一种精确而快速的方法，此方法可以进一步加快经典小鼠遗传学中候选基因的验证过程；更重要的是，此方法的可行性在小鼠模型中已经得到了验证，可以期待，不久的将来，在人类遗传疾病的治疗方面，我们也可以使用等位基因特异性敲除的方法，来破坏发生了突变的致病的等位基因但同时保持正常的等位基因的完整性，从而为人类疾病的治疗提供全新的思路。