油菜核糖核蛋白复合体介导的DNA-free基因组编辑系统的创建

The development of site-specific DNA level mutation is the long-term dream for biologists and breeding scientists. CRISPR-mediated genome editing system has been recently proven to be effective for targeted gene editing in a wildly range of organisms, including rice, maize, wheat and cotton. With the achievement of rapeseed genome sequencing and sequence assembly, the GWAS-associated high throughput gene identification researches were extensively performed in many research teams, although its study partner, genome editing technology, has not been developed. In this study, a set of CRISPR-Cas9/CRISPR-Cpf1-mediated DNA-free genome editing system will be specifically optimized for rapeseed genome through combining our previous studies and the latest progress on this technology. And then the transgene-free long silique length/high seed weight Bnarf18 mutant and semi-dwarf Bnrga mutant will be artificially generated using this system. Take together, the completion of this multifacted genome editing platform will be benefit for oilseed rape gene functional study and subsequent application of genetic engineering.

对基因组进行定点改造，一直是生物学家和育种家的梦想。目前，CRISPR介导的基因组编辑系统已经在多个主要农作物中成熟应用，如水稻、玉米、小麦和棉花等。随着油菜基因组的测序和序列组装工作的完成，各种基于GWAS相关的高通量功能基因挖掘工作大量展开，但与之配套的基因组编辑系统仍未成功报道。本项目将以项目组前期的研究工作为基础，结合基因组编辑的最新进展，开发出适合于甘蓝型油菜的CRISPR-Cas9/CRISPR-Cpf1介导的DNA-free（无转基因元件）基因组编辑系统。在此基础之上，人工产生不含转基因原件的甘蓝型油菜的长角果/高粒重Bnarf18及半矮化Bnrga突变体。该系统的创建将建立完善的基因组编辑平台，为甘蓝型油菜的基因功能理论研究和基因工程育种发展服务。

本项目紧密围绕基因编辑技术在油菜育种应用上的难题，通过改造驱动sgRNA表达盒的启动子序列，建立了高效的油菜CRISPR/Cas9基因编辑技术，编辑效率在96.8%到100%之间；为了解决油菜机械化收获过程中角果易开裂的难题，本项目利用已建立的CRISPR/Cas9基因编辑技术对3个抗裂角相关的基因进行了功能解析，成功从5个BnJAG同源拷贝中鉴定了显著提高油菜角果的抗裂角指数的A08拷贝。对抗裂角相关基因BnIND的研究结果表明，BnIND基因A和C基因组上的两个拷贝在抗裂角上存在功能冗余性，A和C拷贝同时突变可以使抗裂角指数从0.02提高到约0.4。对抗裂角相关BnSHP基因的8个同源拷贝的研究表明，BnSHP1A09拷贝可能是参与油菜角果分离层的木质素含量调控的一个关键基因拷贝，而同时聚合BnSHP1A09, BnSHP1C06, BnSHP1C08, BnSHP1C09和BnSHP1A09 可以显著的提高油菜的抗裂角指数。本项目进一步优化了油菜核糖核蛋白基因编辑技术，从3334个再生植株中筛选了5株发生突变的植株，编辑效率约为0.15%，低于前期在单子叶作物小麦（2.2%-4.4%）中的报道。为了解决这个不足，本项目进一步建立了油菜的双单倍体诱导系介导的基因编辑技术，可以通过授粉的方式直接对甘蓝型油菜和甘蓝的育种材料直接进行基因编辑，编辑效率分别为14.41% - 25.36%和4.43% -17.55%，有效的打破了基因编辑技术对育种材料基因型的限制。本项目共产生SCI论文5篇，其中3篇已经接收，2篇正在审稿，申请发明专利1项，培养博士生1名，并与英国的John Innes Centre 建立了联合实验室。