蛋白酶TldD阻抑硫化叶菌细胞生长的分子机制

Caspases-like have similar functions to caspases that also be called death proteases and play critical roles in the regulation of programmed cell death (PCD) in plant and bacteria etc. In recent years, the researchers have detected high caspase-specific activity and expression of immunoreactive proteins to human caspase-8 antisera in the supernatants of Crenarchaeota and other archaeal members, indicating that there would be caspases-like within Archaea, the second major prokaryotic domain of life. However, up to now, the archaeal caspase genes have not yet identified despite the lack of caspase homology genes. In previous study, the applicant had found that Sulfolobus solfataricus protease TldD exhibited immunoreactive to human caspase-8 antisera and homologous overexpression of TldD resulted in Sulfolobus cell growth arrest. In order to reveal the molecular mechanism of cell growth arrested by protease TldD in Sulfolobus, we plan to identify whether Sulfolobus TldD is a caspase-8-like by in vitro biochemical means,such as Western blotting using specific antibodies,enzymatic analysis using specific substrates and inhibitors.The investigate will be carried out to seek for associations of TldD and PCD by knockout and flow cytometric analysis.Furthermore,the cellular proteins that interact with TldD will be fished and identified by pull-down and Co-IP.On this basic, the interactional network framework will be established. Our research will provide morphological,biochemical and genetic evidences for the presence of archaeal PCD, and deepen our understanding of the function of TldD and the origin and evolution of PCD and death proteases.Taken together,this project results have important theoretical value.

类胱天蛋白酶是与胱天蛋白酶（caspase）功能相似的死亡蛋白酶，在植物、细菌等细胞程序性死亡中发挥着关键性的调控作用。古菌胞内类caspase活性的发现，说明古菌域存在类caspase蛋白，不过目前还没有鉴定出与类caspase活性相关的基因，古菌程序性死亡的存在也需要证据支撑。申请人前期研究发现，硫化叶菌蛋白酶TldD具caspase-8的免疫活性，且同源超表达TldD能阻抑细胞生长。为了剖析蛋白酶TldD阻抑硫化叶菌细胞生长的分子机制，本项目拟采用体外生物化学方法鉴定硫化叶菌TldD是否为类caspase-8，通过基因敲除结合流式细胞分析等手段寻求TldD与程序性死亡的关联，并采用Co-IP、pull-down等技术垂钓、鉴定与TldD互作的蛋白。本项目成果将为古菌程序性死亡的存在提供形态学、生化和遗传学证据，加深对程序性死亡及死亡蛋白酶的起源与进化的认识，具有重要的理论价值。

自1972年科学家在动物中发现凋亡，真核生物以及原核生物细菌域中的程序性死亡及各种死亡蛋白酶（caspase和类caspase）被陆续发现，而唯独古菌中是否存在程序性死亡和死亡蛋白酶还缺乏足够的证据支撑。本项目研究前期发现，硫化叶菌TldD蛋白酶超表达能阻抑细胞的生长；流式细胞分析也表明tldD基因超表达菌株出现PCD特征，暗示TldD蛋白可能和古菌的程序性死亡关联。通过生物信息学分析发现，TldD超家族在古菌域和细菌域非常保守且广泛存在。文献表明，细菌域的TldD与毒素抗毒素TA系统关联，与程序性死亡相关。古菌中保守的TldD具有怎样的功能，是否与DNA拓扑异构酶和程序性死亡之间存在着关联？为试图回答这些科学问题，本项目对硫化叶菌中的7个TldD超家族蛋白进行了以下研究：（1）硫化叶菌TldD与类caspase的相关性；（2）硫化叶菌TldD缺失或异常表达对细胞生长的影响，与程序性死亡的关联性分析；（3）垂钓、鉴定与硫化叶菌TldD互作的蛋白。本项目主要取得了以下研究成果：（1）构建了一系列硫化叶菌tldD/tldE家族基因的超表达、缺失、以及保守模序突变菌株；（2）对TldD的生化功能、保守模序功能、底物偏好与切割位点等进行了分析，从生化角度证实了TldD亚家族蛋白具有蛋白酶活性；（3）鉴定到1个无法缺失的硫化叶菌TldD基因SiRe_0953；（4）排除his标签带来的干扰，鉴定到1个能与caspase-8多克隆抗体发生免疫反应的硫化叶菌TldE蛋白SiRe-1253；（5）采用反转录、免疫共沉淀(Co-IP)等技术手段证实TldD和TldE蛋白相互作用形成复合物；（6）通过成活率和生长曲线测定获得了不同TldD基因超表达或缺失表达后的表型；（7）通过RT-PCR方法分析发现不同的硫化叶菌tldD和tldE基因对紫外损伤后的应答表现不同，成对的TldD-TldE下调表达，单独的TldE上调表达；（8）Reverse gyrase可被化学诱变剂MMS或强氧化剂 H2O2处理的细胞粗提物所降解，硫化叶菌TldD作为拓扑异构酶的调节子参与了RG的调节；（9）剖析了硫化叶菌TldD超家族蛋白调控细胞生长的分子机制，为古菌程序性死亡研究提供了大量的形态学、生物化学和遗传学证据。