花粉超低温保存差异蛋白与氧化应激和细胞凋亡关系研究

4 differential expression proteins from pollen of magnolia and peony cryopreservation related to oxidative stress and apoptosis were selected. Their homologue will be used in protocal of pollen cryopreservation by vitrification as additives, while viability of pollen will be determined. The experiment system including kinds of proteins, the concentration of protein, time and method of adding, will be set up to measure indexes of oxidative stress and apoptosis, and the relationship between these proteins and oxidative stress and apoptosis of cryopreservation will be discussed. The aim is to explore fuction of differential expression proteins in cryopreservation mechanism.

以玉兰和芍药花粉为材料，拟从花粉超低温保存中四种与氧化应激和细胞凋亡相关的差异表达蛋白质入手，通过将同类外源蛋白质应用于植物花粉玻璃化超低温保存程序，检验其对花粉生活力的影响，从而确立与影响花粉生活力密切相关的外源蛋白的种类、介入时间、方法、作用浓度等实验体系，进而检测该实验体系的关键环节中花粉氧化应激和细胞凋亡的指证性生理生化指标，探讨这几种差异蛋白与超低温保存中氧化应激和细胞凋亡的关系，从而揭示超低温保存中蛋白作用机制。

项目背景：人类和动物超低温保存研究显示超低温保存过程中形成的活性氧引起的氧化应激，可能是造成生物材料超低温保存损伤的主要原因之一。相关研究还显示，超低温保存中出现的氧化应激不仅可以直接造成细胞损伤，还可能诱导了细胞凋亡。但是植物超低温保存中相关研究报道很少。为了探明植物超低温保存中是否存在氧化应激和细胞凋亡现象，我们开展了该研究。.主要内容：本项目在前期工作基础上，以玉兰和芍药花粉为材料，从我们鉴定的花粉超低温保存中与氧化应激和细胞凋亡相关的4种差异表达蛋白质入手，采用直接液氮冷冻法保存花粉，解冻后立即用含有外源同源物的差异蛋白缓冲液孵育，检测其对液氮冻存花粉生活力的影响，同时测定液氮保存前后表征氧化应激和细胞凋亡的相关指标，探明花粉超低温保存中氧化应激和细胞凋亡的发生情况，并探讨这几种差异蛋白与花粉超低温保存中氧化应激和细胞凋亡的关系。.重要结果：①花粉超低温保存中普遍存在氧化应激和细胞凋亡现象，且是导致花粉超低温保存后生活力降低的重要原因之一。②过氧化氢酶（CAT）、苹果酸脱氢酶（MDH）、丙酮酸脱氢酶（PDH）与热激蛋白70（HSP70）4种差异蛋白在提高玉兰和芍药花粉超低温保存后花粉生活力均有积极作用。但CAT和MDH效果更好，适用种类多且萌发率提高更明显。③用差异蛋白CAT和MDH的外源同源物孵育液氮保存的花粉，能够减轻超低温保存后花粉的氧化应激和凋亡率，从而提高不同种类花粉萌发率1.8%-41%；CAT通过提高内源CAT和AsA抗氧化剂途径起作用，而MDH主要通过提高内源SOD途径起作用。.科学意义：本研究从氧化应激和细胞凋亡角度揭示了花粉超低温保存损伤机制，证实其外源同源物导入可以降低氧化应激和细胞凋亡，提高花粉活力。研究结果对揭示植物超低温保存机制和改进保存技术具有理论和实践意义。