多梳基因EZH2在肝细胞癌浸润转移中的作用及其沉默肿瘤抑制基因的筛选和分子机制探讨

肝细胞癌（HCC）的发生发展是一个多基因改变的复杂过程。最近，我们发现多梳基因EZH2表达上调与HCC浸润转移和预后密切相关。但EZH2在HCC浸润转移中的作用和机制还很不清楚。.本项目拟首先探讨RNA干扰和外源性过表达EZH2对HCC和Lo2细胞浸润转移生物学行为的影响；通过Real-time PCR芯片检测EZH2敲低和EZH2过表达后共同涉及的差异表达基因，筛选EZH2作用的靶基因；免疫组化检测靶基因在HCC组织芯片中的表达及其临床肿瘤学意义。进一步，在基因表达回复实验中锁定EZH2作用的关键肿瘤抑制基因；应用ChIP和荧光素霉报告基因等实验，结合RNA干扰，探讨和确证EZH2及其复合物成员（EED和SUZ12）是否涌过转录因子YY1，Snail或AEBP2募集并沉默相关肿瘤抑制基因；IP实验分析它们之间的结合与作用方式。综合分析并确定EZH2沉默的关键肿瘤抑制基因及其分子机制。

EZH2是一种癌基因，其编码蛋白是多梳基因家族（Polycomb Group Family, PcG）的重要成员，它可通过三甲基化组蛋白H3K27（H3K27ME3）导致相关的抑癌基因沉默，从而促进肿瘤发生和发展。我们前期研究证实, EZH2在肝细胞癌（HCC）组织和细胞中存在高频的表达上调，而且与HCC侵袭和转移及患者的不良预后显著正相关。本项目旨在探讨EZH2在HCC浸润转移中的分子功能与作用及其调控机制。在研究中我们首先应用anti-H3K27ME3的全基因组染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)和全基因组表达谱芯片分析法, 从全基因组范围筛选EZH2介导的H3K27ME3及其直接沉默的下游靶基因；并通过生物信息学方法对靶基因进行功能分析和变化差异排序，确定HCC恶性进展中EZH2直接作用的关键候选肿瘤抑制基因。进一步，我们在一系列的体外和体内试验中，对差异表达最大的候选靶基因CLDN14在HCC侵袭和转移中的功能及作用机制进行了深入的研究。另外，我们采用相关的分子肿瘤学方法对HCC中EZH2表达上调的分子机理及其作为HCC潜在治疗靶点进行了系统的探讨。研究结果显示：EZH2-H3K27ME3高表达与HCC侵袭和转移密切相关；EZH2可通过直接作用于一系列靶基因的组蛋白H3K27ME3抑制靶基因的表达。CLDN14是EZH2直接调控和沉默最明显的肿瘤抑制基因（靶基因），并在EZH2-H3K27ME3介导的HCC恶性进展中发挥重要作用。深入的机制研究表明：EZH2可以通过CLDN14基因的H3K27ME3，从表观遗传学上明显抑制CLDN14基因的转录和表达，进而激活“WNT/β-catenin”通路以促进HCC细胞的侵袭和转移。另外，在HCC中EZH2表达上调的机制研究中，我们通过一系列的体内外研究证实：miR-101不仅可通过靶向作用于EZH2，还可通过靶向作用ROCK2，STMN1和COX2等靶基因，调节HCC细胞的骨架蛋白和上皮-间质转化（EMT），并在HCC小鼠和鸡胚模型中抑制血管生成，从而抑制肿瘤细胞的浸润和转移。以上研究结果提示：EZH2基因可以通过“EZH2-H3K27ME-CLDN14-WNT/β-catenin”信号通路促进HCC细胞的侵袭和转移，是抗HCC转移治疗中一个新的治疗靶点和途径；miR-101是HCC的潜在抑制因子。