雌激素受体α在小鼠囊胚形成中的作用及其机制

It is a milestone of mammalian embryonic development that after fertilization, the embryos go through preimplantation stages and form blastocysts. A competent blastocyst is prerequisite for successful conception, during which the blastocyst implant onto the uterus wall. In spite of extensive researches studying the mechanisms underlying blastocyst formation, the key factors that orchestrate diverse signaling pathways remain elusive. We have initially revealed that estrogen receptor alpha (ERα) expressed throughout mouse preimplantation development, and localized mainly in the outer layer cells rather than the inner cells during blastocyst formation. Further studies showed that the blastocyst formation was blocked obviously，and the protein level of the trophectoderm differentiation gene Cdx2 was also downregulated when 8-cell embryos treated with ERα selective antagonist (MPP), suggesting that ERα has a regulatory role in the trophectoderm differentiation. The present research project will firstly complete the preliminary experiments, and uncover the contribution of maternal ERα or/and zygotic ERα duing trophectoderm differentiation by maternal ERα knockout and maternal/zygotic ERα knockout; then establish trophoblast stem cell lines, and study the effects of ERα knockdown (by siRNA) on the ERα-binding sequences within the promoter/enhancer of target genes; and furthermore, study the changes on the expression of trophectoderm core genes by using ERα-binding sequence-specific Crispr/Cas9 knockout experiments; and finally, study the roles of these promoter/enhancer sequences during trophectoderm differentiation in the mouse preimplantation embryos by zygote microinjection. So the results will reveal the detailed mechanisms underlying the regulation of trophectoderm differentiation by ERα, and promote the development of the theory and technology of blastocyst culture and implantation in assisted reproductive technology.

功能完整的囊胚是成功受孕的基础，但囊胚形成的具体调控机制仍未清楚。前期研究发现雌激素受体（ER）α在小鼠植入前胚中全程表达；且在囊胚形成期，外层细胞定位显著高于内层细胞；用ERα特异性抑制剂处理8-细胞胚，可导致囊胚形成受阻，且使滋养外胚层分化基因CDX2蛋白表达下调，故推测ERα对滋养外胚层的形成有着调节作用。本项目拟在前期实验的基础上，单独敲除母源ERα和同时敲除母源与合子型ERα，明确ERα在囊胚形成，特别是滋养外胚层分化中的作用；建立滋养层干细胞系，研究ERα siRNA敲减对关键靶基因启动子/增强子上ERα结合序列的影响；然后进一步分析经Crispr/Cas9序列敲除后，滋养外胚层关键基因的表达变化；最后通过显微注射，在小鼠植入前胚中验证这些启动子/增强子的协调机制。结果将揭示ERα在滋养外胚层分化中的具体作用和机制，成果将促进辅助生殖技术环节中囊胚培养与植入理论和技术的提升。

日本学者于1999年运用RT-PCR对ICR小鼠植入前胚内ERα mRNA进行检测，ERα mRNA见于卵母细胞、受精卵、2-细胞胚和4-细胞胚，8-细胞胚未检测到，桑葚胚和囊胚又出现表达。本课题组前期实验结果表明，ERα蛋白在小鼠植入前胚全程都有表达，在桑葚胚-囊胚过渡阶段，外层细胞的ERα蛋白水平显著高于内层细胞，提示ERα在囊胚滋养外胚层形成过程中具有重要作用。第一，ERα在小鼠囊胚形成中的作用。本实验运用ERα siRNA和ERα特异性抑制剂及激动剂处理小鼠受精卵，明确 ERα 在囊胚形成中的作用，及其对滋养外胚层关键基因的影响。并建立小鼠滋养层干细胞系和母源及其与合子型 ERα敲除小鼠模型做进一步验证。结果如下：（1）ERα siRNA转染小鼠1-细胞胚将导致植入前胚胎阻滞于桑葚胚阶段，且Cdx2表达水平显著降低；（2）运用ERα特异性抑制剂MPP处理小鼠8-细胞胚同样导致植入前胚阻滞于桑葚胚阶段，Cdx2表达水平降低。此外，MPP处理后会导致Yap表达水平降低。（3）运用ERα特异性激动剂PPT处理小鼠8-细胞胚24h后出现大规模腔化，且囊胚腔直径在80μm以上的成熟囊胚数目明显多于KSOM组。以上结果提示，ERα可能通过Hippo信号通路影响桑葚胚阶段Cdx2的表达，从而参与囊胚形成。（4）运用5μM MPP处理小鼠滋养层干细胞（TSCs）后， TSCs克隆团出现叠加在单层细胞上的细胞团块，且实验组中较大的克隆团上可见叠加生长的细胞团块，此处Yap核内定位也不明显。而对照组Cdx2蛋白强阳性细胞主要位于克隆团的外围，MPP处理后阳性细胞向克隆团中部聚集。以上结果进一步提示，ERα在小鼠TSCs细胞形态维持中具有重要作用，且机制与通过Yap调节Cdx2表达密切相关。（5）转基因小鼠实验结果表明，单独母源ERα敲除，不影响囊胚发育，母源与合子型ERα同时敲除，囊胚发育率降低。提示桑葚胚阶段重新出现的合子型ERα对囊胚形成具有重要作用。而本课题后续将收集小鼠桑椹胚，运用Cut-tag技术验证实验结果是否准确。以上结果将阐明ERα参与小鼠囊胚形成的调控网络，从而达到克服早胚体外发育阻滞的目的，同时，也为我们进一步研究提供新思路和线索。