雌激素受体α在小鼠合子型基因激活中的作用和机制

受精卵体外培养是辅助生殖和胚胎工程中关键技术之一，但受精卵体外培养存在着发育阻滞现象。因此，克服体外发育阻滞成了植入前胚体外发育研究的关键问题。植入前胚体外发育阻滞的根源是合子型基因激活（ZGA）失败，但ZGA的机制还远未完全阐明。配体或非配体依赖性的ERα活化在生理功能和病理变化方面发挥重要作用，但来源于卵母细胞的母源性ERα在合子型基因激活中的作用至今未见报道。本课题组预实验发现：用ER拮抗剂ICI 182780和ERα特异拮抗剂MPP均使小鼠受精卵在体外培养时出现2-细胞阻滞，提示ERα在ZGA中起着重要作用。本课题将建立小鼠2-细胞胚ERα正常表达和ERα降解的实验模型，研究ERα与存活信号通路PI3K/AKT的关联，及其对合子型基因激活候选基因c-Myc的转录和转录后的调节，从新的角度阐明ERα在ZGA及2-细胞阻滞中的作用及分子机制，为促进植入前胚体外发育阻滞的克服提供新方法。

有研究表明，卵母细胞和受精卵高表达ERα mRNA，从2-细胞胚开始下降，提示ERα是母源基因，且植入前胚能自分泌营养因子，为植入前胚内ERα的非配体依赖性活化提供可能。本研究建立2-细胞胚内ERα正常表达和ERα核表达抑制的两种细胞模型，研究ERα在合子型基因激活中的作用和机制。结果发现：第一，ERα参与调控小鼠合子基因组激活（ZGA），结果如下：（1）ERα和Ser118磷酸化ERα在1-细胞胚和2-细胞胚的动态分布，提示ERα参与基因转录调控；（2）ER抑制剂（ICI182780）、ERα特异性抑制剂（MPP）和ERα特异性抗体对小鼠2-细胞至4-细胞过渡具有抑制作用； MPP使ZGA相关基因MuERV-L mRNA表达水平和2-细胞胚核内ERα蛋白下调，说明ERα参与调控小鼠ZGA；（3）MPP明显抑制SOX2蛋白表达，而对c-Myc和Oct4的表达没有明显影响，提示ERα参与Sox2基因转录调控，影响合子基因组的激活；（4）MPP明显抑制Cyclin D1蛋白表达，同时， MPP组Brdu参入显著减少，说明ERα调控ZGA与其调控S期启动有关；（5）ERα调控ZGA与其影响2-细胞胚内miR-125b-5p和miR-125a-5p表达有关。第二，PI3K/Akt通过影响ERα调控ZGA，结果如下：（1）PI3K抑制剂LY294002降低小鼠1-细胞胚的体外发育率，下调2-细胞胚内eIF1A mRNA的表达；Akt磷酸化抑制剂API-2和MK2206能抑制1-细胞胚体外发育，明显减少2-细胞胚核内Akt-Ser473磷酸化蛋白和eIFlA水平，说明Ser473磷酸化Akt参与合子基因激活；（2）LY294002 使小鼠2-细胞胚内p-ERα蛋白水平明显降低，而MPP对Akt、p-Akt蛋白水平没有显著变化，表明抑制PI3K/Akt信号通路可下调ERα活性。第三，Pin1与ERα存在相互作用，参与调控ZGA。结果如下： Pin1特异性抑制剂Juglone明显抑制2-细胞向4-细胞过渡以及SOX2的表达水平，且影响2-细胞胚核内Ser118磷酸化ERα蛋白的表达。同时，发现1-细胞胚和2-细胞胚内ERα与Pin1存在共定位现象。上述结果阐明 ERα在 ZGA 及 2-细胞阻滞中的作用及机制，为促进植入前胚体外发育阻滞的克服提供新思路。