基于印迹基因甲基化修饰的针刺提高IVF来源卵母细胞质量的研究

In-Vitro Fertilization (IVF-ET) is one of the key component of Assisted Reproductive Technology(ART). At present, comparatively low clinical pregnancy rate and the long-term effects on the offspring are all concerned. The high quality of oocytes is the prerequisites for embryo development and implantation. Therefore, improving the quality of oocytes is crucial to ensure positive clinical outcomes of IVF-ET. As all we knew acupuncture promotes follicular development, improves the quality of oocytes, and the quality of oocytes closely related to its epigenetic characteristics, this project is based on the methylation level of imprinted genes in the formation of maternal gametes. We hypothesize that "acupuncture help to improve the quality of oocytes by modifying the establishment and maintenance of methylation of imprinting genes during ovulation induction" . Immunohistochemical detection DNA methyltransferase level, high-throughput sequencing will be adopted to detect the methylation site, MeDIP-qPCR to validate the sequencing results to select the type of imprinting genes that related to acupuncture intervention on ovarian hyporesponsive model rats. Then the results are going to verified on patients with ovarian dysfunction as well. Our findings will reveal the epigenetic mechanism of acupuncture in improving oocytes’ qulity, and help to provide scientific evidence for reducing genetic risk of IVF-ET progeny, also promote the development of ART.

体外受精-胚胎移植（IVF-ET）是辅助生殖的关键技术之一，目前该技术的临床妊娠率不高及其对子代的长远影响均是备受关注的问题。优质的卵母细胞是保证胚胎正常发育的前提，因此，提高卵母细胞质量是改善IVF-ET临床妊娠率的关键。基于针刺能够促进卵泡发育、提高卵母细胞质量、卵母细胞质量与其表观遗传特性密切相关的基本事实，本课题以母系配子形成期印迹基因甲基化水平为研究切入点，提出“针刺通过修饰促排卵期间印迹基因甲基化的建立和维持，从而提高卵母细胞质量”研究假说，以卵巢低反应模型大鼠为研究载体，采用免疫组化检测DNA甲基转移酶水平，高通量测序检测甲基化位点，MeDIP-qPCR验证测序结果，筛选出与针刺作用相关的印迹基因类型；再以卵巢功能低下患者为研究对象进一步验证相关印迹基因，探索针刺提高卵母细胞质量的表观遗传学机制，为降低IVF-ET子代遗传疾病风险、促进ART的发展提供更丰富的科学研究依据。

本课题以71例卵巢低反应（POR）患者为研究对象，采用外周血及卵泡液的DNA甲基化芯片检测观察针刺干预对POR患者可能存在的DNA甲基化异常的调整效应。还以30只小鼠为载体，随机分为四组（促排组、针刺促排组、模型促排组、针刺促排模型组），使用scBS-seq技术探索POR模型小鼠与对照小鼠的卵母细胞甲基化水平差异，以及针刺治疗POR的DNA甲基化机制。最后以30只小鼠的卵巢组织为载体（空白组、模型组、针刺组），观察POR小鼠卵巢组织的DNA甲基化差异以及针刺后的DNA甲基化修饰状态的改变。.研结果发现，足疗程针刺干预可以改善卵巢功能，促进POR患者在促排卵期间卵泡的均衡发育和批量成熟，提高体外受精率、可利用胚胎率和优势胚胎率，为胚胎的冻融和移植提供了充分的储备。POR患者卵泡液及外周血DNA甲基化水平均发生显著改变，卵泡液中与针刺效应相关程度显著的差异性甲基化位点/区域分布在HOX、DGAT1、SOX2、CASP8基因上，而更多效应分子富集在Wnt、Ca2+通路上。小鼠卵母细胞分析提示，差异性甲基化位点/区域富集程度较高的ErbB、Hippo、TGFβ/Smads通路可能与POR病理机制密切相关；针刺后DNA甲基化水平整体以下调为主，Igf1r及Cdk5rap2的甲基化水平降低与针刺效应相关程度最高，与此同时有大量差异性甲基化位点/区域富集的Wnt、GnRH、Ca2+通路。卵巢组织分析提示，针刺可能与下调 TGFBR3､Bcl2､Rxra､Nfkb1基因的甲基化水平及调节 PI3K/AKT 信号通路关键效应分子的甲基化修饰密切相关。.综上，本研究验证了针刺对POR的积极临床效应，首次通过表观基因组学探索针刺改善POR卵巢功能，提高卵泡发育及胚胎发育潜能的机制，其中Wnt、Ca2+通路或可成为进一步探索针刺改善卵巢功能表观遗传机制的生物标记。