血小板来源的miR-126参与动脉粥样硬化内皮损伤修复的机制研究

The balance of damage and repairment in endothelial cells(ECs) is the one of the most important point in the process of astherosclersis.The enhancement in repairment of ECs can cure atherosclerosis. The recent study showed circulating micoRNAs are stable，which can be transferred into ECs and influence the function of ECs. Our study indicated that miR-126 is involved in the angiogenesis formation and the repairment followed by damage. Interesting,we found that circulating miR126 is not decreased in ECs-miR126 knock-out mice which indicated that circulating miR126 is not only come from ECs.the fresh report showed that active PLT can secreted miR126 which may be the another origin of circulating miR126.We hypothesis that secreted miR126 from PLT can be transferred in ECs and impact the function of self-repairment involved in the process of atherosclerosis. In the study, the knock-out mice will be used and lots of biochemial methods will be applied,such as cell culture,ultra-centrifugation，flow-cytometer,immunofluorescence,western blot, qPCR. This study can be helpful to find a new mechanism of ECs repairment and a new method to treat the atherosclerosis.

内皮细胞损伤修复失衡是动脉粥样硬化发生发展的重要环节，提高内皮细胞的修复能力可防治动脉粥样硬化。新近研究提示循环血中稳定存在游离小RNA，能以某种形式传递并影响内皮细胞的功能。我们前期工作证明miR126参与维持脉管的结构和功能，参与内皮损伤修复。我们在已经建立的内皮细胞miR126条件性敲除小鼠的研究中发现，循环血中miR126仍维持较高水平，提示血中miR126其非内皮细胞单一来源。最新研究提示血小板可能是血浆中miR126的另一重要来源。我们假设在动脉粥样硬化内皮细胞损伤后，血小板被激活释放大量miR126入血，被受损内皮细胞接受后，通过调节miR126的靶基因参与内皮细胞损伤后修复，一定程度阻止动脉粥样硬化的进程。本研究拟利用敲除小鼠，采用细胞培养，超速离心，流式细胞，免疫荧光，蛋白印迹，定量PCR，病理染色等手段验证假设，为动脉粥样硬化内皮损伤后修复机制寻找新的思路和治疗方法。

血小板来源微泡（PMP）参与了动脉粥样硬化中内皮细胞损伤和修复，本课题通过分离血小板微泡对动脉粥样硬化过程中重要细胞的作用，结合运用生物信息学、细胞生物学等方法和技术，对PMP中miRNA参与调控动脉粥样硬化过程中内皮、单核巨噬细胞的功能和机制进行了初步研究。首先通过梯度离心法获得稳定的PMP，并通过流式细胞仪、纳米颗粒追踪分析技术、多维全景流式细胞仪成像、投射电镜等方法对其进行形态和功能鉴定；进而通过细胞生物学技术发现内皮细胞能够内化并且吸收微泡，PMP可以促进氧化应激诱导的内皮细胞凋亡、细胞内ROS的产生及IL-1β的分泌，抑制内皮细胞迁移和NO的分泌；在研究PMP对单核巨噬细胞的影响时发现其增强巨噬细胞吞噬Ox-LDL作用，促进IL-1β、IL-6、TNF-α分泌，促进单核细胞与黏连蛋白(FN)及内皮细胞的粘附能力；miRNA方面，通过RT-PCR方法发现，PMP处理后的内皮细胞中miR-223、miR-320显著升高，腺病毒转染miR-223能够促进氧化应激诱导的内皮细胞凋亡、抑制内皮细胞迁移，但对细胞内ROS的产生、炎症因子及NO的分泌明显影响，通过Targetscan软件及文献回顾预测NRF1、ATP7A、ZEB1三种miR-223的靶基因；PMP处理后的单核细胞中miR-155、miR-191、miR-150的显著升高；动物研究中发现动脉粥样硬化小鼠体内PMP中的miRNA-223水平升高；ApoE上可能存在PMP中miR-223对血脂水平调节的作用靶点；miR-301b-3p在M-CSF诱导的单核巨噬细胞自噬时表达量显著增高，过表达miR-301b-3p显著促进M-CSF诱导的单核细胞自噬，其中MYB、CYLD为miR-301b-3p作用的靶基因。该项目研究的技术意义在于，对血小板微泡的分离、纯化、鉴定进行了系统的研究，摸索了一套血小板微泡获取的确实方法；应用前景为两点，一为抗血小板治疗防治动脉粥样硬化提供了更为丰富的理论基础，而为血小板微泡的功能学研究，尤其在炎症，血管新生，粥样斑块形成等方面的研究提供了基础。