水稻减数分裂DSB形成相关基因DFA1的克隆与功能研究

In meiosis, homologous recombination plays vital roles in generating genetic diversity as well as maintaining the genomic stability. The programmed formation and effective repair of DNA double-strand breaks (DSBs) are prerequisites for homologous recombination. Therefore, studies on the molecular mechanisms of these events are of great importance for understanding the process of meiosis. In our previous work, a rice mutant, dfa1, was found showing both male and female sterility. Cytological investigations revealed that in the meiocytes of the mutant, homologous pairing and synapsis were disrupted and 24 univalents were observed at metaphase I. Furthermore, the γH2AX immunosignals used to mark DSBs could not be detected on the meiotic chromosomes in dfa1. These results suggest that DSBs formation is abolished in the mutant. We further identified the candidate gene by map-based cloning. Bioinformatics analysis indicated that DFA1 is a novel and plant-specific gene encoding an unknown protein. In this proposal, we intend to ascertain its spatio-temporal expression pattern, screen proteins that interact with DFA1, and clarify the relationship between DFA1 and other determinant meiotic elements using a combination of genetics, molecular biology, proteomics and biochemical techniques. By studying the function of DFA1, we seek to uncover its molecular mechanisms involved in formation of DSBs and regulatory networks during meiosis.

在减数分裂过程中，同源重组对于维持物种遗传多样性和染色体稳定性有着极其重要的意义。同源重组发生的首要条件是DNA双链的主动断裂及其后续的有效修复，因此研究减数分裂过程中DNA双链断裂和修复的分子机理，对于解析减数分裂过程的分子机制具有十分重要的意义。我们在前期研究中发现一水稻不育突变体dfa1，该突变体同源染色体不能配对和联会，在减数分裂中期I形成24个单价体，同时，标记DNA双链断裂的γH2AX抗体不能在染色体上产生免疫信号，表明它是一个DNA双链断裂缺陷突变体。进一步通过图位克隆方法已初步鉴定出候选基因，生物信息学分析表明该基因是高等植物中特有的、编码一个未知功能蛋白的新基因。本课题拟在此基础上综合运用遗传学、分子生物学、蛋白组学以及生物化学的方法明确DFA1的时空表达特性、互作蛋白以及与其它重要减数分裂蛋白的关系，最终揭示DFA1 在减数分裂过程中参与DSB形成的分子机理和调控网络。

同源重组是减数分裂过程中最为核心的事件之一，而DSB的形成则是发生同源重组的首要前提。DSB由一类在进化上非常保守的SPO11蛋白催化完成，该蛋白属于DNA拓扑异构酶VI的A亚基的同源蛋白，目前在各物种中研究较多，而对于拓扑异构酶VI的另一组分B亚基的同源蛋白参与减数分裂的报道，则相对较少。而且在不同物种间，这些蛋白的序列并不十分保守，对于其参与DSB形成的机制和调控网络依然没有研究清楚。在此背景下，本项目通过图位克隆的方法，获得了一个水稻中参与减数分裂DSB形成的因子DFA1。因该蛋白与拟南芥MTOPVIB存在结构上的相似性，故又被命名为OsMTOPVIB。在OsmtopVIB突变体中，染色体都是以单价体的形式存在于终变期，同时也观察不到DSB指示标记γH2AX的信号，而且在双突变体背景下，DSB修复缺陷突变体Osrad51c和Oshus1的表型被抑制，表明在突变体中DSB是不能正常形成的。生化实验表明OsMTOPVIB不仅具有双链DNA结合活性还具有双链DNA切割活性。此外，OsMTOPVIB与OsSPO11-1以及OsSPO11-2具有相互作用，说明OsMTOPVIB可与OsSPO11-1以及OsSPO11-2三者形成蛋白复合体来共同完成DNA双链的切割功能。免疫荧光定位实验表明OSMTOPVIB蛋白定位在染色体线圈上，且需要CRC1和PAIR3蛋白的参与。OSMTOPVIB蛋白的准确定位对于后期重组相关的蛋白OsDMC1、OsCOM1、OsRAD51C以及OsMER3是必不可少的。.本研究通过在水稻中发现一个新的DSB形成因子OsMTOPVIB，阐明了该蛋白的生化特性以及生物学功能。对于加深减数分裂DSB形成机制的理解，明确DSB形成的调控网络，都有着极其重要的作用。