一个水稻减数分裂纺锤体组装相关基因的克隆与功能研究

Gametogenesis in both animal and plant reduces the diploid genome content of germline cells to a haploid state in gametes through a sequence of two meiotic cell divisions called meiosis I and II. However, the assembly of the microtubule-based spindle that mediates this reduction process remains poorly understood in plant. Previously, we obtained a rice sterile mutant, with multipolar spindles at metaphase I in pollen mother cells, named it msp1 (multiple spindle pole 1). In msp1 meiocytes, the multipolar spindles may not be revised into bipolar spindles, leading to abnormal chromosome segregation and sterile gametes. We isolated the candidate gene MSP1 by map-based cloning. It encodes an unknown protein with a conserved ATP-binding domain. In this proposal, we are going to conduct cytological observation, immunofluorescence and the three-dimensional structured illumination microscopy assays to investigate MSP1 function in meiotic spindle assembly. We further intend to analyze the potential MSP1-interactional proteins by yeast two-hybrid screening and CO-IP. These findings would not only to elucidate MSP1 function during rice meiosis, but also shed light on the mechanism of meiotic spindle assembly in plant.

减数分裂过程中，纺锤体组装对染色体正确分离至关重要。纺锤体组装在不同物种间很不保守，甚至在同一物种的雌雄配子发生过程中也存在差异。但相关工作主要集中在果蝇、线虫、爪蟾等模式动物中，认为纺锤体组装主要由中心体介导，植物纺锤体研究相对落后，特别是对性母细胞减数分裂纺锤体组装和极性形成的认识还相当有限。我们利用在水稻中获得的减数分裂多极纺锤体突变体msp1(multiple spindle pole1)，图位克隆了相关候选基因MSP1，该基因编码一个含有ATP-binding结构域的未知蛋白。本项目拟在此基础上，系统研究水稻减数分裂纺锤体组装的细胞学过程，并通过酶活分析、互作蛋白筛选、基因编辑等，系统研究MSP1蛋白的生物学功能，阐明其在纺锤体组装中的分子机制。

有性生殖过程中，减数分裂纺锤体组装对染色体的正确分离至关重要。纺锤体组装机制在不同物种间很不保守，关于植物纺锤体，特别是对性母细胞减数分裂纺锤体组装和极性形成的认识还相当有限。.前期研究中我们通过图位克隆获得了减数分裂纺锤体组装异常的突变体msp1，后续证明该突变体是OsMTOPVIB的一个等位突变，会影响减数分裂程序性的DNA双链断裂 (DSB)的形成，同源染色体不配对，中期I染色体呈现24个单价体，后期I染色体被分向多极。通过免疫荧光实验，我们发现相比于野生型中的正常两极纺锤体，msp1突变体中期I存在大量多极纺锤体。四分体时期，有大量多分体产生，结果表明MSP1的突变影响两极纺锤体的建成。msp1突变体中，后期I着丝粒和微管的连接是单极连接，而Osrec8 msp1双突变体中，着丝粒-微管的连接均为双极连接，双突变体中不形成多极纺锤体，说明动粒-微管的双极连接可以促进两极纺锤体的形成。同时我们获得MSP1互作蛋白OsPRD2（拟南芥AtMPS1）的CAS9敲除突变体，并证明OsPRD2很可能与MSP1共同参与调控水稻减数分裂DSB形成；而Osprd2中期I至后期I细胞中两极的纺锤体聚集弥散，微管呈近平行状排列，导致两端纺锤体的宽度约为野生型纺锤体的2倍。同时后期I至末期I滞留于细胞板的染色体仍会与一端纺锤体有连接。以上结果说明，尽管OsPRD2和MSP1存在相互作用，且共同参与减数分裂DSB形成，但是它们在减数分裂纺锤体组装的调控中存在差异。.通过上述研究，我们不仅证明了MSP1，即OsMTOPVIB能通过影响着丝粒-微管的连接来调控减数分花粉母细胞中纺锤体的组装和极性形成。还证明了MSP1的互作蛋白OsPRD2也参与水稻减数分裂DSB形成和纺锤体调控。研究结果解析了植物中纺锤体的组装过程及调控机制，并补充完善了不同物种间纺锤体的组装机制。