水稻ASP1基因参与DSB形成的功能研究

Meiotic recombination plays an important role in maintenance of both genome stability and genetic variability for eukaryotes, which is initiated by DNA double-strand breaks (DSBs). Accompanying with repair of DSB, recombination is achieved. Spo11 is a homolog of a subunit of archaebacterial topoisomerase, catalyzing meiosis DSB together with its accessory proteins in budding yeast. But genes mediate DSB formation and repairing are not conserved across species. Only a few of these genes have been cloned and functionally identified in rice. In our previous studies, we have identified a rice DSB deficient mutant, asp1. It shows normal vegetative growth but abnormal homologous pairing, synapsis and γH2AX antibody immunofluorescence signals. Map-based clone technique was used to clone the target gene and we have got the sequence of the candidate gene. According to the sequences of the candidate gene and its prediction function, the genes affecting meiosis DSB formation reported in rice were excluded. In this proposal, we are going to over express and knock out the target gene to verify its function. A polyclonal antibody of the target gene would be prepared. Double mutants would be constructed between ASP1 and several other identified meiotic genes. We are also going to perform fluorescence in situ hybridization（FISH）, immunodetection of the ASP1 and other meiosis specific proteins, yeast two hybrid, bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay， electrophoretic mobility shift assay (EMSA) to study the biological function of the target gene in rice meiosis.

减数分裂过程中同源重组起始于DNA的双链断裂(Double-Strand Break，DSB)，并伴随DSB的修复而完成同源重组，但介导DSB形成和修复的关键基因在生物界并不保守。目前水稻中已经克隆和鉴定的DSB形成基因远少于酵母和哺乳动物。我们在前期工作中通过辐射诱变获得了一个水稻DSB形成缺陷突变体asp1。该植株表现为营养生长正常，但完全不育，并且减数分裂期染色体上检测不到γH2AX抗体的免疫荧光信号。已通过图位克隆方法获得了候选基因，它与已报道的水稻减数分裂基因均不等位。本项目拟在此基础上，进一步构建该基因与其它减数分裂关键基因的双突变体，表达目的蛋白的多克隆抗体，结合目的蛋白和减数分裂其它关键蛋白抗体的免疫荧光染色反应、荧光原位杂交、电泳迁移率实验、酵母双杂交、双分子荧光互补等手段，研究该基因在减数分裂过程中的生物学功能，为最终解析水稻减数分裂调控的分子机制提供新的证据。

同源染色体内交换和重组是一个复杂的生物学过程，包括同源染色体配对、联会和交换等一系列相关的生物学事件，这些事件正常有序地完成才能确保减数分裂过程的正常实现，其调控机理复杂。我们通过γ射线照射水稻成熟种子，在其后代中通过表型观察、减数分裂期染色体鉴定、γH2AX抗体免疫荧染色反应等实验筛选获得DSB（double-strand breaks）形成缺陷突变体asp1；通过图位克隆方法获得了目的基因，并对目的基因功能进行了验证，确定目的基因ASP1为PRD1；免疫荧光染色反应表明PRD1蛋白定位于细线期染色体上，在粗线期与着丝粒蛋白CENH3共定位; prd1突变体在减数分裂过程中有多极纺锤体的特点，明显不同于正常水稻减数分裂中、后期呈现的两极纺锤体，也因此造成了prd1减数分裂中染色体分离的紊乱。而且，PRD1与着丝粒定位蛋白MIS12和NDC80发生相互作用，进一步证明PRD1对于减数分裂中、后期两级纺锤体的形成起了重要作用。REC8是减数分裂黏着素组份，是联会复合体的轴向原件，在后期I早期从染色体臂上解离，但在着丝粒处一直维持到减数第II次分裂，在rec8突变体中，减数分裂特异的着丝粒黏结消除，导致姐妹染色单体的着丝粒为两级取向，姐妹染色单体在减数第I次分裂中发生分离，但rec8 prd1-1双突变体中期I姐妹染色单体的着丝粒为两级取向，表明单价体内姐妹染色单体着丝粒双极取向促进双极纺锤体的形成。prd1 rad51c 双突变体中期I呈现24个单价体，进一步证明PRD1参与DSB形成的功能；spo11-1 prd1-1双突变体中期I有24个单价体，但多级纺锤体特点类似于prd1-1；mtopVIB prd1-1双突变体染色体行为和多级纺锤体特点类似于单突变体；且PRD1与MTOPVIB以及PRD1与PRD2存在相互作用，说明PRD1、MTOPVIB和PRD2可能形成复合体参与水稻减数分裂DSB的形成。另外，在项目执行期间，我们对水稻减数分裂关键基因ATM和RAD51的功能进行解析，ATM作用于SPO11-1等蛋白介导的DSB下游，并与DMC1平行参与减数分裂同源重组，RAD51和DMC1在水稻减数分裂同源重组过程中有功能上的依存关系。