肺炎克雷伯菌毒力调控子CRP的功能研究

转录调控子在细菌毒力的调控中起着不可替代的作用；大量研究表明转录调控子CRP与很多革兰阴性细菌毒力相关；肺炎克雷伯菌是临床常见条件致病菌之一，其毒力表达调控研究具有重要意义。.本研究假设：肺炎克雷伯菌转录调控子CRP通过调控毒力基因的转录，控制着肺炎克雷伯菌的致病力。.主要研究内容：系统分析肺炎克雷伯菌crp突变株的毒力表型，采用DNA芯片表达谱技术，结合生物信息学分析，筛选CRP候选靶基因；进而运用定量RT-PCR、凝胶阻滞实验技术，确证CRP直接调控的靶基因；选择若干关键毒力基因，采用lacZ融合报告基因技术、DNA酶I足迹实验技术、引物延伸实验技术，研究CRP是如何直接调控这些基因的转录和表达；认识CRP如何通过调控特定毒力基因的表达，控制着肺炎克雷伯菌的毒力。

以肺炎克雷伯菌转录调控子CRP为研究对象，对肺炎克雷伯菌crp 突变株的生长特性和毒力表型进行分析的基础上，用生物信息学预测CRP可能直接结合的毒力靶基因，然后用凝胶阻滞试验、RT-PCR、DNA酶Ⅰ足迹实验以及LacZ报告基因融合试验，对CRP是如何通过调控特定毒力基因的表达而控制着菌株的毒力开展了系统的研究。.建立了基因无痕敲除技术平台，成功构建了突变株Δcrp；同时构建了回补株C-Δcrp；对突变株、回补株、野生株的生长特性和毒力表型进行分析，发现突变株Δcrp的生长速度明显变慢、超黏性减弱、小鼠半数致死量(LD50)高于野生株和回补株，表明调控子CRP可能正向影响肺克雷伯菌的生长，同时可能正向调控菌株的毒力基因。用生物信息学分析可能的受CRP调控的靶基因，从中挑出26个候选基因，通过定量RT-PCR和凝胶阻滞实验，鉴定了12条可能受CRP直接调控的基因。根据上述实验结果，选取3-5条可能受CRP直接调控的毒力基因，进一步用lacZ报告基因融合实验技术、DNA酶I足迹实验进行CRP调控的精细机制研究，结果LacZ报告基因融合实验证明了CRP能够正调控与毒力相关的KP1_1984、KP1_1986、KP1_1992和KP1_1993基因，CRP通过增加毒力相关基因的表达，从而增强肺炎克雷伯菌的毒力。DNA酶Ⅰ足迹实验找到了CRP与靶基因启动子区的具体结合位点，详细的阐述了CRP的精细调控机制。综合以上试验结果，将表型试验与分子生物学试验结合起来，认识到转录调控子CRP可能是通过调控毒力基因KP1_1984、KP1_1986、KP1_1992和KP1_1993控制着肺炎克雷伯菌的毒力。.经过课题组成员的共同努力，完成了研究内容，达到了研究目标。同时本课题组建立了一套系统研究转录调控子调控靶基因的分子机制的研究思路和技术平台，为后续开展其他转录调控子功能研究奠定了基础，并积累了经验。