肺炎克雷伯菌转录调控子RcsAB的功能研究

Klebsiella pneumonia (KP) is one of the most important pathogen resulting in the acquired infections and nosocomial infections. The existence of many virulence factors and the ability of biofilm formation is the main cause to lead to its strong pathogenic and serious repeated infections and multi-drug resistance. The transcriptional regulators play an important role in the regulation of virulence and biofilm formation. It has the vital significance to prevent and cure the infection caused by KP to study the function of the transcriptional regulator. .This study focuses on the functions of transcriptional regulator RcsAB of Klebisella pneumoniae in the regulation of virulence-related genes. Based on the system analysis of the phenotypes of virulence and biofilm formation ability of mutant ΔrcsA, ΔrcsB and ΔRcsAB, and identification of the regulatory elements of RcsB and RcsAB, to confirm that they control different cellular pathway respectively. Some virulence-related genes and biofilm formation genes were chosen to study further in order to determine the target genes regulated by RcsAB using quantitative RT-PCR and electrophoresis mobility shift assay (EMSA) and then to know how the RcsAB regulate the transcription of these genes. The objective of this project is to recognize how RcsAB regulate the self-control of RcsA, virulence and biofilm formation by regulating RcsA itself encoding genes, capsule polysaccharide synthesis gene and other related genes.

肺炎克雷伯菌(KP)是引发获得性感染和医院内感染的最重要病原菌之一。众多毒力因子的存在和极强的生物膜形成能力是导致其具有较强致病性及引起反复感染与多重耐药的主要原因。转录调控子在毒力与生物膜基因的调控中起着重要作用，研究调控子功能对防治KP菌的感染具有重要意义。.本研究以KP菌转录调控子RcsAB为切入点，在系统分析ΔrcsA、ΔrcsB、ΔrcsAB突变株的毒力与生物膜表型基础上，采用比较转录组分析技术结合生物信息学预测，鉴定RcsB与RcsAB各自的调控元，证实二者分别调控不同的细胞途径；选择若干关键毒力与生物膜相关基因，运用定量RT-PCR和凝胶阻滞实验技术，鉴定RcsAB直接调控的靶基因，深入研究RcsAB如何直接调控这些基因的转录，从而认识RcsAB是如何通过调控RcsA自身编码基因、荚膜多糖合成基因及其它相关基因，进而分别控制RcsA自我调控、毒力、生物膜形成。

本课题以肺炎克雷伯菌(KP)转录调控子RcsAB为研究对象，在对RcsAB突变株进行一系列毒力表型分析的基础上，从分子水平上研究了RcsAB对候选靶基因的调控关系。.构建了突变株ΔrcsA、ΔrcsB和ΔrcsAB及相应的回补株。对突变株和回补株的毒力相关表型(菌体粘度、菌落透明度、生物膜形成量等)进行了分析，结果表明突变株的菌体粘度减弱、菌落透明度增强、生物膜形成量减少，回补株中生物膜表型都得到部分回复，而菌体粘度试验只有rcsB回补株部分回复。以上表明转录调控子RcsAB可能参与调控菌体生物膜和荚膜多糖的形成，但荚膜染色观察，未发现突变株有明显变化，推测RcsAB可能不是调控荚膜多糖的形态，而可能是荚膜多糖的结构或数量。进一步细胞毒性和小鼠毒力试验结果表明突变株毒力有一定减弱，但回补株的表型未得到回复。以上表型实验表明RcsAB参与菌株毒力的调控。.LacZ报告基因融合试验和EMSA试验验证RcsAB对预测的毒力相关基因的调控关系，LacZ报告基因融合实验结果表明KP1_3726可能受到RcsA蛋白正向调控，RcsB蛋白负向调控；KP1_3552可能受到RcsA负向调控，RcsB正向调控；KP1_1557可能受到RcsAB蛋白的负向调控，而单独的RcsA或RcsB蛋白的调控不明显。EMSA试验证实RcsB蛋白可直接结合在基因KP1_1557、KP1_3552和 KP1_3726启动子区进行转录调控。.从表型分析到分子试验对转录调控子RcsAB进行了研究，表明RcsAB是一个毒力相关的转录调控子，鉴定了RcsAB直接调控的靶基因和对靶基因的调控关系，为深入认识RcsAB的调控机制奠定了理论基础。