华支睾吸虫厌氧代谢关键酶的功能研究

厌氧代谢关键酶在寄生虫病的诊断、疫苗、新药研发和致病研究中都具有重要意义。华支睾吸虫成虫寄生在胆管的厌氧环境中，是厌氧代谢形式的典型代表。本课题前期已对华支睾吸虫厌氧代谢的几个关键酶进行了初步的研究，发现利用华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶作为胶体金免疫层析检测抗原诊断华支睾吸虫病的特异性和敏感度较高，乳酸脱氢酶可能是吡喹酮、阿苯达唑等主要抗蠕虫药物的靶点，抗烯醇酶的抗体可在体外抑制成虫的生长和囊蚴脱囊；此外还发现这几种酶主要定位在虫体表膜，并已证实烯醇酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶是华支睾吸虫的分泌排泄蛋白。在此基础上，本项目将利用生物化学、分子克隆、RNAi干扰、体外细胞实验等方法深入对5个厌氧代谢关键酶的酶学活性、免疫学功能以及其在华支睾吸虫致病中的作用进行研究，确定它们在华支睾吸虫能量代谢中的地位，以加强华支睾吸虫病诊断、疫苗研发、药物靶标筛选、致病分子机制的研究基础。

本项目利用生物化学、分子克隆、体外细胞实验等方法对华支睾吸虫厌氧代谢酶的酶学活性、免疫学功能以及其在华支睾吸虫生长发育、致病中的作用进行了全面系统的研究，初步确定了它们在华支睾吸虫能量代谢中的地位，还探讨了其在华支睾吸虫病诊断、疫苗研发、药物靶标筛选及阐明华支睾吸虫病分子机制中的作用。. 本项目已利用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫及囊蚴全基因组中筛选出华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶、烯醇酶、己糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶等厌氧代谢酶基因，并利用基因操作技术表达、纯化获得它们的重组蛋白；并获得它们的酶动力学相关参数，包括酶活性单位、最适酶反应温度、pH值及抑制剂对酶活性的影响情况等；本项目还分析了上述各个酶的免疫学活性及功能，包括免疫原性、免疫反应性、免疫保护力等；获得了上述酶类在华支睾吸虫不同发育阶段的表达情况，证实其均为华支睾吸虫成虫分泌排泄蛋白成分。. 其中，我们重点研究了华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶（CsGAPDH）、烯醇酶（CsENO）。我们的体外实验表明，重组CsENO可延长虫体存活时间，其抗血清可抑制虫体生长。采用直接浸泡法干扰烯醇化酶表达会使虫体存活时间降低，证明烯醇化酶是华支睾吸虫不可或缺的能量代谢关键分子。我们还证实，CsENO配体分子为纤溶酶原蛋白，烯醇化酶/纤溶酶原系统是病原体易于入侵人体的途径之一，说明CsENO是一种多功能蛋白，可能是参与华支睾吸虫致病的重要分子。在CsGAPDH研究方面，我们证实CsGAPDH具有纤溶酶原结合特性，提示它也可能在华支睾吸虫入侵人体组织过程中发挥一定的作用。我们还发现感染华支睾吸虫大鼠肝脏的胆管腔、胆管内容物、虫体附近肝实质及汇管区有CsGAPDH分布，这证实CsGAPDH是分泌\排泄抗原的成分。进一步，我们发现重组CsGAPDH可结合于肝星状细胞（HSC）和胆管上皮细胞的细胞膜表面，且这种结合并不是通过纤溶酶原实现的。低浓度的重组CsGAPDH蛋白可促进HSC增殖，而高浓度的蛋白则可使HSC凋亡。这些结果说明CsGAPDH在华支睾吸虫感染中，在对肝纤维化的关键细胞的凋亡与激活的平行中发挥作用。. 我们的研究表明，华支睾吸虫的厌氧代谢酶大多是多功能蛋白，对其进行深入研究将有助于阐明华支睾吸虫致病机制等，为提出华支睾吸虫病防治新的策略提供理论支撑。