Klf4/Twist1逆转心包肌骨母细胞至间质细胞的作用和机制研究

纤维和/或钙化(FAOC)是多种心包疾病进展和自体心包修复材料衰败的关键事件，核心为心包间质细胞向肌骨母细胞转分化；而逆转细胞分化有望成为FAOC治疗的突破口。前期实验中，我们观察到Klf4/Twist1转录因子组合(TF)可启闭肌骨母细胞表型。为进一步明确TF逆转肌骨母细胞表型的作用和机制，本课题拟完成：1.检测TF对不同分化阶段肌骨母细胞表型的逆转作用，在此基础上优化TF组合；2. 采用染色质免疫沉淀、基因芯片等技术逐步分析Klf4/Twist1蛋白结合的靶基因，利用信号通路调节剂明确TF逆转肌骨母细胞表型的分子机制；3.通过检测干细胞相关基因的表达，观察肌骨母细胞表型逆转过程中是否存在去分化状态；4. 构建体内和体外FAOC模型，采用病理学等方法明确TF对FAOC进展的作用。通过此研究，力图阐明TF作用机制，明确细胞表型逆转化阻止FAOC进展的可行性，为心包FAOC防治提供理论依据。

心包纤维钙化是心包损伤修复和多种心包疾病共同的病理学特征，是导致缩窄性心包炎患者出现心包限制症状和心包材料衰败的重要原因。为了检测纤维钙化心包中的主要细胞类型，标本切片进行细胞特异性染色。结果表明Discoidin domain receptor 2 (DDR2)-阳性的心包间质细胞(Pericardial interstitial cells,PICs) 是正常心包组织的主要细胞类型。而纤维钙化心包中α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）和Cbfa1/Runx2双阳性的肌骨母细胞是主要的细胞类型，提示该细胞在心包纤维钙化进展过程中发挥着重要作用。为此，我们分离培养心包肌骨母细胞观察其生物学特征并探索调控其细胞表型的方法。.形态学上，心包肌骨母细胞呈现衰老表型，高表达炎症、纤维化及钙化相关基因（与正常PICs的mRNA相比）： E-selectin（21倍）、interleukin-6（8倍）、MCP-1（2倍）、TNF-α（54倍）、CTGF（5.3倍）、fibronectin（3.4倍）、collagen type I（3.9倍）、collagen type III（3.4倍）、TIMP-1（1.8倍）、osteopontin（1.8倍）、bone sialoprotein（244倍）、osteonectin（2.4倍）。随后的transwell实验发现心包肌骨母细胞粘附的CD45阳性单核淋巴细胞、沉积钙盐的能力明显高于心包间质细胞。而且天狼猩红比色法检测证实心包肌骨母细胞中含有的胶原蛋白明显高于心包间质细胞。.为了观察Klf4、Twist1对肌骨母细胞表型调控作用，细胞分别转染Klf4、Twist1。结果表明短期内Klf4促进p53基因的转录、并抑制I型胶原和III型胶原的mRNA表达，而Klf4对α-SMA的表达则无明显作用；腺病毒感染5周后，Klf4抑制α-SMA的表达。而且Oct4能增强Klf4的作用，α-SMA、ALP、Cbfa1/Runx2的mRNA水平分别降低了63%、60%、54%，为此在后续功能实验中增加Oct4。Twist1能显著抑制RUNX2及其下游产物osteocalcin (OCN)、osteopontin (OPN)的表达，并抑制alkaline phosphatase (ALP)活性。免疫沉淀