调节植物疫病病原菌—疫霉菌无性生殖孢子囊产生的内源激素的化学及生物学研究

Phytophthora caused potato late blight and led to the Great Irish Famine, resulted in the deaths of millions of people from hunger. Phytophthora is causing devastating plant diseases worldwide and brings about more than 10 billion dollars economic losses every year. Sexual reproduction is the way of its evolution. However, asexual reproduction is its important means of breeding, spreading and leading to diseases. To isolate 1.2 mg mating hormone alpha1 which induces sexual reproduction of Phytophthora, I spent several years to culture more than 1800 liters broth from more than 1000 culture bottles. The structure of hormone alpha1 was determined. Then the research strategy was moved to discovery of endogenous hormone which stimulates sporangium formation of asexual reproduction. After 6 years intensive study, a stable and effective bioassay system was established. Existence of endogenous hormone was confirmed. After continually optimize production condition and purification scheme, a relative pure hormone was obtained. The purpose of this project will focus on increasing amount of production and optimization purification procedures, work on large scale culture, obtain enough amount of hormone for structure elucidation, determine the structure of the hormone. The structure will be confirmed by total synthesis. Design and synthesize molecular probe for identification of the specific receptor of the hormone. This will lay the foundation for the future specific target identification and clarification of the mechanism of action of asexual reproduction initiated by the hormone.

疫霉菌（Phytophthora）导致爱尔兰大饥荒，致使上百万人饿死，现在造成全球每年过百亿美元的损失。有性生殖是其进化的途径，而无性生殖则是其繁殖、流行并导致疫病的重要手段。申请人曾经过多年努力，从1000多个培养瓶培养的1800升疫霉菌培养液纯化到1.2毫克性激素alpha1，确定了其化学结构。随后，将工作重点转移到发现刺激疫霉菌无性生殖孢子囊产生的内源激素上；经过6年的深入研究，建立了较稳定有效的生物活性鉴定系统，证实了内源激素的存在；不断对其生产及纯化条件进行优化，得到一定量较纯净的该内源激素。本课题的目的是继续优化该激素产生的条件及纯化方案，进行更大规模的培养，纯化得到足够量的该内源激素，确定其化学结构；通过化学合成等方法验证确定的化学结构。进行构效关系研究，设计、合成为发现其特异性受体为目的的分子探针，为发现特异性受体以及阐明该激素启动的疫霉菌无性生殖的作用机制奠定基础。

为了分离纯化调节疫霉菌无性生殖孢子囊产生的内源性化合物，共进行了近十万个皿的液体培养，得到2000多升疫霉菌的培养液。由于该物质具有挥发性，因此，在前期研究中因为没有掌握该理化性质，按照常规方法进行分离纯化，导致活性物质挥发，造成巨大损失。在总结经验教训后，根据掌握的活性化合物的理化性质，确认该活性分子中有羟基和酮基的存在，同时根据发现疫霉菌有性生殖荷尔蒙alpha1的经验，即在alpha1的分子的羟基上引入对溴苯甲酰基后生物活性没有发生显著变化（疫霉菌可能存在酯键的水解酶）的实验结果，开发了在完成二次开口柱分离后利用对溴苯甲酰氯进行化学反应引入对溴苯甲酰基的新纯化方法，该方法使小分子化合物的挥发性大大降低，但对生物活性没有显著影响，从而获得了调节疫霉菌无性生殖孢子囊产生的信号分子的衍生物，由于该物质含量极低，无法按照常规根据波谱数据确定化学结构，因此根据衍生物的核磁共振氢谱及质谱推测了该荷尔蒙的化学结构，设计并合成了该分子，合成的化合物的生物活性实验证实该分子在纳克级具有非常显著的调节疫霉菌无性生殖孢子囊产生的活性，活性呈现剂量关系，在300纳克可以诱导非常大量的孢子囊产生，以上结果证实该化合物具有非常显著的调节疫霉菌无性生殖孢子囊产生的活性。目前研究工作进展顺利，正在进行构效关系研究，设计合成以发现受体蛋白质为目的的分子探针。该成果为研究疫霉菌无性生殖孢子囊的产生、疫霉菌无性生殖的分子机制以及控制疫霉菌的战略奠定了重要基础，项目取得重要成果。进一步的深入研究不仅可以开发控制疫霉菌的特异性农药，而且为新型特异性抗生素的开发奠定重要研究基础。.此外，在项目资金对支持下，还选择了全球危害较大的植物病原菌禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）作为生物模型（在前面的年度总结中多次已向基金委报告过进行该项研究。），寻找调控其无性生殖分生孢子产生的内源性信号分子，发现并确认了调控无性生殖分生孢子产生的荷尔蒙的化学结构为一新的倍半萜类化合物并命名为FARI。并对FARI的作用机制进行了初步研究。