拟神经生长因子活性天然产物衍生物的靶标发现及作用机制研究

Alzheimer's disease is one of the most harmful diseases to old people. There is no drug to cure the disease. Substance possessing nerve growth factor (NGF) mimic activity is promising to treat AD. In our previous study, new benzoates with NGF mimic activity were isolated from a traditional Chinese medicine - Gentiana rigescens Franch. Based on the structure-activity relationship study of more than one hundred benzoate derivatives, tetradecyl 2,3-dihydroxybenzoate (renamed as ABG-001) was decided to be a lead compound. ABG-001 exhibited very significant neuritogenic activity on cell evaluation systems. Results of animal experiments showed that ABG-001 possesses neurotrophic and neuron protective functions. It can promote nerve regeneration. This project intends to apply the chemical biology strategy, design and synthesize molecular probes possessing ABG-001 skeleton and exhibiting equivalent activity as ABG-001. The potential target proteins of ABG-001 will be detected by using these probes. In the meantime, utilize modern techniques and methods, such as gene chip technology, study drown stream signaling pathways of ABG-001 target and the special mechanism of action of ABG-001 should be clarified. This study will provide guidance for anti-AD drug development of ABG-001.

阿尔茨海默症（Alzheimer's disease，AD）是对老年人危害最大的疾病之一, 无治愈药物。具有拟神经生长因子（nerve growth factor, NGF）活性的物质有望用于治疗AD。在前期发现的中药龙胆拟NGF活性新苯甲酸酯及合成的上百个衍生物构效研究的基础上，确定2,3-二羟基苯甲酸十四酯 (命名为ABG-001)为活性先导化合物。细胞实验结果显示ABG-001具有非常显著的拟NGF活性。动物试验结果表明ABG-001具有显著的神经营养和保护作用，能促神经再生。本项目拟应用化学生物学的策略、方法和手段，设计并合成ABG-001的分子探针，发现其靶标，通过RT-PCR、免疫印迹、siRNA等实验进行验证。同时，利用多种现代技术和方法，特别是基因芯片技术，研究ABG-001拟NGF活性的靶标下游的信号通路，阐明其特殊的作用机制，为ABG-001抗AD药物研发提供支持。

前期研究从中药龙胆提取物中发现了系列具有拟神经生长因子（NGF）活性及结构新颖的苯甲酸酯类化合物。在上100个衍生物构效关系研究的基础上，发现了活性先导化合物—2, 3-二羟基苯甲酸十四酯（命名为 ABG-001），动物实验的结果表明苯甲酸酯类化合物不仅具有显著的促神经再生及神经保护功能，而且安全性很好。因此，ABG-001是一个源头创新的抗阿尔茨海默病（AD）的候选药物，化合物靶蛋白的发现和确认对原创新药的研发意义重大。.首先，设计合成了ABG-001烷基链末端带炔基的拟NGF活性与ABG-001相当的活性探针分子（ABG-P1）以及比ABG-001在苯环的3位上少一个羟基的阴性对照探针分子（ABG-PC）。然后，利用合成得到的小分子探针，通过“click”反应对ABG-001的靶蛋白进行了发现研究。用活性或无活性的小分子探针作用于PC12细胞一定时间后，收取PC12细胞全蛋白裂解液，向全蛋白裂解液中加入连有叠氮的Cy5荧光染料（Cy5-N3）及匹配的反应试剂，进行“click”反应。通过对比有活性探针和无活性探针的荧光条带，找到了多个和活性小分子探针结合的蛋白条带。随后，进行了量效和时效关系研究及竞争性实验。根据实验结果，有两个有荧光的蛋白条带随剂量和时间均有较好的变化。因此，将这两个蛋白条带切下，用于蛋白鉴定。通过消化、质谱分析，并将得到的蛋白质多肽图谱与数据库中的多肽指纹谱图进行比对，得到了多个候选蛋白，包括Hsc70，GRP78和14-3-3 theta等。利用蛋白抑制剂、细胞热转变分析（CETSA)等化学生物学和生物化学实验方法，验证了Hsc70是ABG-001诱导PC12细胞发生神经突起伸长的潜在的靶蛋白，最后，利用siRNA干扰的方法进行进一步验证。.以上研究成果为ABG-001体内作用机制研究以及ABG-001的成药性研究等药物研发奠定了重要基础。进一步的体内作用机制研究已经展开，发现ABG-001促神经再生，显著改善AD鼠记忆功能障碍的药效与ABG-001直接作用于大脑神经系统以及ABG-001调控肠道菌群稳态和调控菌群产生调控神经系统的小分子化合物有密切关系，ABG-001可能具有全新的抗AD机制。.此外，该项目还对其它具有潜在抗AD药效的多种天然产物及其衍生物进行了较深入的发现及作用机制的研究，为抗AD原创药物的研发奠定了重要基础。