从树突细胞共刺激分子表达研究补肾健脾方治疗慢性乙型肝炎的免疫机制

既往研究表明,肝肾阴虚兼肝郁脾虚是慢性乙型肝炎（CHB）部分免疫耐受期的基本病机，补肾健脾方是治疗该期CHB的有效验方，可通过调控树突细胞(DC)功能恢复免疫应答。DC共刺激分子PD-L1高表达是CHB免疫耐受的关键机制。在既往研究基础上，提出并论证补肾健脾方可通过影响CHB部分免疫耐受期患者DC的PD-L1表达改善DC功能,恢复HBV免疫应答的假说。研究内容：（1）比较免疫耐受、部分免疫耐受和免疫清除期的CHB患者外周血和肝脏组织DC的 PD-L1及其受体PD-1（T细胞）的表达差异；（2）补肾健脾方对部分免疫耐受期患者外周血和肝组织DC/T的PD-L1/PD-1表达的影响；（3）深入研究补肾健脾方下调PD-L1的分子机制（MAPK和PI3K信号通路）。通过探讨补肾健脾方调控DC/T的PD-L1/PD-1的表达及其机制，明确中药治疗部分免疫耐受期CHB的优势环节，科学阐释其中医病机理论。

本项目主要研究补肾健脾方对慢性乙型肝炎（CHB）树突状细胞（DCs）共刺激分子表达的影响及其分子作用机制。（1）纳入37例免疫耐受期和31例免疫清除期CHB患者，分离外周血单个核细胞（PBMCs），流式细胞仪检测T细胞PD-1的表达；DCs上PD-L1、CD86、CD40、CD80的表达，结果表明：与免疫清除期相比，免疫耐受期CHB患者外周血CD4+T细胞PD-1的表达明显升高（P <0.05），CHB患者外周血DCs和mDCs上PD-L1的表达明显升高（P <0.05）。（2）纳入32例ALT轻度异常CHB患者（肝脏病理炎症等级≥G2以上者），两组患者在恩替卡韦抗病毒治疗的基础上，治疗组给予补肾健脾方治疗，对照组给予中药安慰剂治疗，疗程均为12个月。分离PBMCs，研究治疗前后T细胞上PD-1和DCs上PD-L1、CD86、CD40、CD80的表达变化。结果表明：与治疗前相比，两组患者外周血及肝脏内浸润的CD4+T细胞PD-1的表达水平明显降低（P <0.05），治疗组CD8+T细胞PD-1的表达水平降低。与治疗前相比，治疗组DCs和mDCs上PD-L1的表达水平明显降低（P <0.05）。治疗组mDCs上CD40、CD80的表达水平明显升高（P <0.05）。（3）分离健康者的PBMCs，磁珠分选（负选法）单核细胞，在培养基中加入GM-CSF、IL-4、TGF-β诱导为成熟的DCs。加入rhHBcAg 10g/ml分别作用12h、24h、48h、72h，检测PD-L1的表达变化及DCs上MAPK和PI3K/AKT信号分子磷酸化水平。在培养基中加入10%的补肾健脾方药物血清，加入rhHBcAg 10g/ml作用48h，收集细胞，检测PD-L1的表达变化。结果表明：rhHBcAg能够上调DCs上PD-L1的表达水平，且在作用48h时PD-L1 mRNA的表达水平最高（P<0.01）。PI3K/AKT、ERK、P38信号分子抑制剂均可降低rhHBcAg诱导的PD-L1表达水平（P<0.01）。rhHBcAg能够上调ERK、P38信号分子的磷酸化水平。补肾健脾方能够降低rhHBcAg诱导的PD-L1表达水平（P<0.05）。本项目共发表论文23篇，其中SCI论文3篇，出版专著1部，获得授权发明专利1项，获得科研成果奖励5项。培养博士研究生1名，硕士研究生1名。