通过肝细胞自噬对干扰素诱导通路的作用研究补肾健脾方治疗慢性乙型肝炎的机制研究

One of the mechanisms of chronic hepatitis B is the suppression of interferon production after hepatitis B virus (HBV) infection. We have found that inhibition of HBV infection of hepatic cells early autophagy can enhance the production of interferon, and the bushenjianpi recipe (Lingmao recipe) can enhance the formation of type I interferon and inhibit HBV replication by inhibiting the early autophagy of hepatocytes. So we hypothesise that the bushenjianpi recipe (Lingmao recipe ) could regulate the production of interferon by autophagy. We design experiments to observe the effect of bushenjianpi recipe (Lingmao recipe) to the expression of proteins in interferon-inducible pathway (TLRs, RLRs, STING) and the copy of HBV in the HBV-infected NTCP-HepG2 cells and autophagy gene (Atg7) knockout inhibits autophagy in mice.From the pros and cons, we hope to confirm that the bushenjianpi recipe (Lingmao recipe) inhibit the hepatocyte autophagy ,which inhibit interferon-induced pathway, and promote the production of interferon,,and to define the immune mechanism by which the bushenjianpi recipe (Lingmao recipe) treat chronic hepatitis B.

乙型肝炎病毒（HBV）感染后抑制干扰素产生是乙型肝炎慢性化的机制之一，前期研究发现抑制感染HBV的肝细胞早期自噬可增强干扰素的产生，补肾健脾方（灵猫方） 能够抑制肝细胞早期自噬，增强I型干扰素的形成，抑制HBV复制。因此我们提出假说“补肾健脾方（灵猫方）通过自噬影响干扰素诱导通路，从而调节干扰素产生”。应用HBV感染NTCP-HepG2细胞诱导的肝细胞自噬，尾静脉注射HBV质粒感染自噬基因（Atg7）敲除抑制自噬的小鼠模型，观察有无肝细胞自噬条件下补肾健脾方（灵猫方）对干扰素诱导通路（TLRs、RLRs、STING）中关键蛋白表达、乙肝病毒复制（HBsAg、HBeAg、HBVDNA、HBVRNA）的影响，从正反两方面，证实补肾健脾方（灵猫方）抑制肝细胞自噬调节干扰素诱导通路，促进干扰素的产生，明确补肾健脾方（灵猫方）治疗慢性乙型肝炎的免疫机制。

研究背景：补肾健脾方（灵猫方，简写LMF）通过抑制肝细胞早期自噬增强I型干扰素（IFN)的形成，抑制乙肝病毒（HBV）复制。研究目的是证实LMF通过IFN诱导通路与自噬关系，调节IFN。研究内容：方法：1）HBV感染NTCP-HepG2诱导细胞自噬， 研究LMF对细胞模型的IFN诱导通路（RLRs、TLRs、STING）中关键蛋白表达、HBV复制的作用。2）LMF对尾静脉注射HBV质粒感染小鼠模型（TLRs、RLRs、STING）通路中关键蛋白表达、HBV复制的作用。3）自噬基因（Atg7）敲除小鼠（Atg7-KO小鼠），尾静脉注射HBV质粒感染Atg7-KO小鼠，TLRs、RLRs、STING通路中关键蛋白表达、HBV复制的变化。结果：1）HBV感染NTCP-HepG2诱导细胞自噬后，LMF组与NS组相比，WB检测TLR3、p-IRF3表达明显增加（P <0.05，P <0.05），RT-PCR检测细胞内IFNβmRNA明显升高（P <0.01），ELISA检测上清HBsAg表达明显下降（p<0.01）；TLR3激动剂poly（I：C）作用于细胞模型后，与NS相比，WB检测LC3II/I下降（P<0.05），IFNβ明显增加（P<0.01）免疫荧光法检测与HBV重叠处LC3针尖样表现明显减少（p<0.05）；TLR3 siRNA转染细胞模型后，WB检测LC3II/I上升（P<0.05），IFNβ明显减少（P<0.01），免疫荧光法检测与HBV重叠处LC3针尖样表现明显增加（p<0.05)。2）LMF灌胃HBV感染小鼠3天，与NS组比，LMF可明显抑制小鼠肝细胞LC3II/I表达（p<0.01),增加TLR3表达(p<0.01)，升高p-IRF3表达（p<0.01），肝细胞内IFNα、βmRNA明显升高(p<0.05)，p<0.01)，小鼠血清中HBsAg表达明显下降（p<0.01）。3）HBV感染（Atg7-KO小鼠），抑制肝细胞自噬，与HBV感染C57小鼠相比，小鼠血清中HBsAg表达明显下降（p<0.01），肝脏免疫组化HBsAg阴性。 Atg7-KO小鼠可明显提高肝脏p-IRF3表达，提高肝细胞内IFNa、βmRNA表达。结论： LMF通过增强TLR3表达，增强p-IRF3表达，抑制肝细胞自噬，促进IFNβ产生。科学意义： 明确LMF治疗CHB部分免疫机制。