机械牵张对肺血管内皮通透性的影响及作用机制

Mechanical ventilation is an important means to rescue the acute respiratory distress syndrome (ARDS)，which inappropriate application will lead to or aggravate lung injury. permeability pulmonary edema is an important pathological features of ARDS, mechanical ventilation will directly affect the vascular endothelial permeability is unclear. Therefore, in this research may provide a new theoretical perspective and a new target for the treatment of ARDS. This subject intends through the application of human pulmonary artery and pulmonary microvascular endothelial cells in vitro stretch model, to study the influence of stretch to cell permeability and the mechanism of molecular biology. By regulating cell-specific adhesion proteins (VE-cadherin of claudin-5 expression of caveolin-1) expression and activity in a rat model of mechanical ventilation, explore the paracellular and transcellular signaling pathway of vascular permeability. Provide a new approach for clinical targeted therapy.

机械通气是抢救急性呼吸窘迫综合症（ARDS）的重要手段，若不适当应用会引发或加重肺损伤。ARDS的重要病理特征为通透性肺水肿。过往研究肺水肿的病理机制局限于肺泡上皮细胞，而忽视了肺血管内皮细胞的协同作用。前期研究证明机械通气会影响血管内皮通透性改变，但机理不清。我们推测调节血管内皮细胞通透性的细胞间途径（VE-cadherin,claudin-5,）及跨细胞途径（caveolin-1）的特异性信号通路，可能为ARDS治疗的新理论和新靶点。本课题拟通过应用人肺动脉和肺微血管内皮细胞，研究体外机械牵张刺激对细胞通透性的直接影响及分子生物学机制。并在大鼠油酸所致急性肺损伤、机械通气模型中探讨通过调节细胞特异性粘附蛋白（VE-cadherin,claudin-5, caveolin-1）的表达、活性及其相互间作用对肺水肿的影响。本研究结果将为临床靶向治疗提供充分的科学依据和崭新的途径。

机械通气是抢救急性呼吸窘迫综合症（ARDS）的重要手段，若不适当应用会引发或加重肺损伤。ARDS 的重要病理特征为通透性肺水肿。我们建立血管内皮细胞透通性改变模型。选用HPAEC、HPMVEC两种细胞，选用不同的牵张强度，不同的牵张时间长度进行机械牵张。应用Western Blot（WB）、RT-PCR 技术检测参与细胞间连接（粘附连接、紧密连接）的关键蛋白分子（VE-cadherin、claudin-5、caveolin-1）的表达水平、活化形式、等，确定机械牵张影响的关键蛋白。细胞动态分析仪法以及Transwell小室/异硫氰酸荧光素（FITC）-白蛋白法均证实机械牵张会导致肺血管内皮通透性增高。研究结果表明，机械牵张可上调HPAEC和HPMVEC细胞炎症因子的表达，且对这两种细胞的炎症反应程度有差异性。机械牵张会导致肺血管内皮通透性增高，这种增高可能是通过下调内皮细胞通透性关键蛋白VE-cadherin、Claudin-5和Caveolin-1的表达所造成，且HPAEC和HPMVEC这两种细胞对机械牵张力反应有差异性。. 保护性通气策略已广泛应用于ARDS患者的救治，但其死亡率并未得到明显改善。我们假设机械通气可以诱导氧化应激和肺纤维化，是行机械通气ARDS患者死亡率高的原因。其中Midkine（MK）起着关键作用。通过收集ARDS患者血液标本，检测MK的表达水平，发现ARDS患者血浆中MK表达水平明显高于健康对照组。人肺上皮细经HCl刺激后行机械牵张，发现上皮细胞发生间质转分化，且同时可观察到ACE表达升高。siRNA沉默MK, Notch2或NADPH氧化酶1，可以降低上皮间质转分化程度。MK基因敲除鼠经HCl滴入行机械通气，与野生型小鼠比较，基因敲除鼠胶原沉积、羟脯氨酸表达水平和肺顺应性明显降低。. microRNA亦参与机械通气诱导的上皮间质转分化过程。我们应用20%机械牵张人原代小气道上皮细胞（SAEC），发现miR-19b通过直接下调PTEN的表达水平，进而激活AKT通路促进机械牵张诱导的上皮间质转分化。