机械牵张所致特异miRNA对呼吸机相关性肺损伤炎症反应的影响及作用机制的研究

呼吸机相关性肺损伤（ventilator-induced lung injury, VILI）是机械通气最严重的并发症之一，其诊治困难。miRNA是一类近年来新发现的非编码小RNA，研究表明其对基因表达调控的功能遍布生物体的发育、新陈代谢、癌症发生发展等各种生命活动，已成为生命科学各领域的研究热点。有证据表明，miRNA在炎症反应的中亦起着重要作用。本项目通过建立机械牵张肺泡Ⅱ上皮细胞miRNA表达谱，明确与机械牵张相的miRNA谱系，并深入研究其在炎症反应分子信号调控通路中的作用机制，寻找其可能的靶分子，探讨其成为呼吸机相关性肺损伤诊断及预后的标志物的可能，并为其治疗提供新的理论视角和新的分子靶点。

机械通气在重症监护病房应用日益广泛。适当的机械通气可以改善病情，而过度机械通气可导致呼吸机相关性肺损伤(Ventilation induced lung injury, VILI)，其特征是肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞受损，毛细血管基底膜暴露,引起局部炎症细胞激活和炎症反应放大,诱导或加重肺损伤。肺泡II型上皮细胞(Aveolar typeⅡ，AT-Ⅱ)是机械通气损伤的主要靶点之一，作为一种组织干细胞，它具有十分重要的功能。深入研究机械通气对肺泡II型上皮细胞功能的影响，有助于明确VILI在基因水平的分子调节机制。miRNA是近年来新发现的一类非编码小RNA，通过与靶基因3’UTR结合抑制靶基因的翻译，影响其稳定性。主要参与细胞增殖、凋亡、分化等生物学过程。大量研究表明，miRNA在疾病中发挥着重要作用。.本研究探讨机械牵张原代培养AT-Ⅱ miRNA表达，在miRNA层面上深入研究VILI，为其预防和诊治提供一个新的视角。我们通过体外分离培养人原代AT-Ⅱ， proSP-C和Cytokeratin-8双标免疫荧光染色、proSP-C和AQP-5双标免疫荧光染色、α-ENaC免疫荧光染色、Green DND-26荧光分子探针染色、透射电镜观察细胞超微结构等来鉴定原代AT-Ⅱ。同时，我们也检测了不同培养时间的8个基因表达及利用TNF-α刺激后检测细胞反应性。实验证明，分离培养的是肺泡II型上皮细胞。鉴定完毕后，应用0%，5%，20%机械牵张原代ATII，通过miRNA芯片技术建立机械牵张相关的miRNA表达差异谱，得到5%机械牵张组有2个miRNA上调，有2个miRNA下调；20%机械牵张组有23个miRNA上调，有15个miRNA下调。从中选取15个miRNA进行实时定量PCR验证，其中11个miRNA得到PCR扩增结果，根据PCR结果挑选5%牵张、20%机械牵张有统计学意义的miRNA，进行靶基因预测及靶基因DAVID功能注释，得到几条可能与机械牵张相关的信号通路。为后续的miRNA在呼吸机相关性肺损伤分子机制的研究提供了很好的参考。