面向蛋白淀粉样纤维化动态过程的质谱新方法开发

Amyloid fibrils have been recognized as the potential origin for over fifty different human diseases including Alzheimer’s disease and type II diabetes. Detailed understanding of the molecular mechanisms of their origin and inhibition is central to prevention and therapy of such diseases. It has been shown that the most toxic form of amyloid fibrils is the oligomeric intermediates accumulated in the early stages of fibrillation at least for neurodegenerative diseases. Those oligomers usually exist in heterogeneous forms. Moreover, due to their extreme instability, they are very difficult to be purified in decent amount or even be detected. In this project, we seek to combine the strength of ion mobility and non-denaturing mass spectrometry, establishing a novel set of tools for the capture and characterization of protein unfolding and amyloid formation. In particular the conformation change of monomers, detailed structures of dimers and higher order oligomers, conformational transition of pre-fibrillar intermediates and related cytotoxicity are among the most challenging targets. We anticipate the valuable insight gained through this research will greatly benefit the early diagnosis and intervention treatment, enabling high-throughput mass spectrometry screening potent in assessing and identifying drug leads.

蛋白淀粉样纤维化是超过50多种人类退行性疾病的元凶，其中著名的有阿茨海默症和Ⅱ型糖尿病。深入了解蛋白淀粉样沉积的形成及抑制机制对于此类疾病的预防和治疗至关重要。有证据表明神经退行性疾病中，淀粉样蛋白细胞毒性最强的形式是纤维化过程中形成的寡聚中间体；然而，这些低聚蛋白在溶液中非常不稳定，通常以高度异质性形式存在，很难捕捉或大量获取。为此，我们将在新近发展起来的离子淌度和非变性质谱技术的基础上，建立蛋白去折叠形成淀粉样聚集的动态过程的质谱研究方法，探测从单个蛋白开始的构象变化，二聚体和低聚物的精确结构，它们是如何形成较大的团块，以及与此相关的细胞毒性机理。这些研究将产生关于相关疾病的早期诊断和干预治疗的非常有价值的信息。在此基础上发展高通量的新的质谱检测方法可用于快速评估潜在药物分子与毒性寡聚蛋白的结合及其抑制模式。

蛋白质淀粉样纤维化是涉及一系列结构不同中间状态的复杂过程。其聚合过程的开始，也就是纤维化过程中的初始变性单体和小型寡聚重复单元是毒性最强的型态，然而由于这些低聚物在溶液中通常以高度异质性的形式存在，因而在溶液环境中非常不稳定，也就决定它们很难被大量获取。为此我们成功建立了阿兹海默症相关的β-淀粉样蛋白Aβ40 和Aβ42的稳定表达体系。通过对表达菌株的优化，我们采用rne131基因突变的大肠杆菌宿主进行表达，依靠提高目标mRNA稳定性，从而提高表达水平。为了研究膜蛋白和低聚多肽的潜在相互作用，我们构建了包含有一系列膜蛋白的大肠杆菌膜蛋白表达库。通过对于表达策略，表达载体，编码序列以及表达菌株的优化，我们成功实现了这些蛋白的表达纯化以用于基于质谱的药物治疗靶点研究。针对在质谱分析中如何保持不稳定寡聚态蛋白中间体之间的非共价相互作用，我们开发了一种低能态下胶束辅助的非变性质谱方法，为淀粉样蛋白高阶寡聚中间体的离子淌度质谱研究铺平了道路。利用这些手段，我们采用非变性质谱和离子淌度质谱相结合对淀粉样蛋白Aβ肽的早期聚集展开探索，以Aβ40为对照，我们研究了表面活性剂模拟的膜环境中Aβ42寡聚态的形成并预测其三维结构模型。我们的数据支持Aβ42六聚体可作为神经退行性疾病研究中的一个潜在的治疗靶点。