靶向HSP70-2的miRNA型条件RNAi的抗雄性生育研究

目前男性避孕方法不能满足人们对生殖健康和知情选择的需要，寻找新的最佳避孕靶点就成为男性避孕研究当务之急。热休克蛋白70-2(HSP70-2)特异表达于生精细胞，是生殖过程的关键分子，基因敲除后的雄性HSP70-2 -/-小鼠生精过程停滞而失去生育能力。在本项目中，我们应用miRNA型 RNAi技术于生殖医学基础研究，拟设计由热激调控、具有RNA干扰效应的细胞特异性miRNA 表达体系，首先通过对体外培养细胞转染以实现对HSP70-2的表达的时空调控；然后通过动物的在体实验，研究此可控系统在大鼠体内诱导细胞特异性miRNA 表达的生物学效应，进而观察HSP70-2被阻断后对雄鼠的生育力的抑制及其可逆性，以期从研究思路上和方法创新上有所突破，为男（雄）性避孕找到新的理想的避孕靶点，发展新型男性避孕方法。

本课题从功能而非从组织结构上对精子发生的调控进行了尝试，以期发展新型男性避孕方法。首先依照课题设计书所计划，对小鼠Hsp70-2基因进行相关生物信息学分析和miRNAs序列设计，构建并筛选了针对小鼠hspa2基因的CMV-miRNA干扰载体，其体外培养细胞干扰效率约为53%。随后构建了两个HSP70-2的特异性热激调控miRNA表达载体HSP70/miR-HSP70-2和3×HSE/miR-HSP70-2，并利用其转染体外培养的小鼠生精细胞株GC-2，完成体外培养细胞转染效率及效果的检测。研究结果表明：HSP/miR-HSP70-2与3×HSE /miR-HSP70-2两质粒在对体外培养的生精细胞中Hsp70-2 mRNA的表达能够达到与阳性对照组（65.1％）相当的沉默效率，分别为61.69%和54.43%。蛋白质水平的改变与mRNA的改变具有很好的一致性。动物实验阶段，我们采用了睾丸网注射后电穿孔转染的方法进行了体内实验，实验中发现转染性呈不均质性，实验动物睾丸内仍可见局灶性的正常精子发生；而随后的附睾精子密度、精子顶体完整率、雌雄鼠合笼后受孕情况及产仔平均数都处于较低水平, 精子畸形率随实验时间的延长明显增加，但各实验组组间没有能够呈现出明显的差异性。这一结果的可能原因可能为实验技术本身的局限性，另一方面也反映了体内实验难度及所面临的复杂性。目前我们一方面继续和改进实验，尝试在体精直/精曲小管的多点显微注射脂质体/质粒复合物的技术方法，另一方面对建立条件性RNAi转基因动物动物模型进行尝试性研究。