超声微泡靶向破碎输送条件性表达/低脱靶型RNAi治疗腋臭的比较实验研究

Axillary osmidrosis is a benign disorder that causes functional and emotional problems in Asian patients. Recently surgery is the main therapy, which produces severe side-effects. Deciphering the underlying mechanism for the pathology of osmidrosis and exploring an alternative therapeutic strategy is of great value for osmidrosis. Previous studies by others and us have revealed that increased E-3M2H secretion is the leading cause of the disease, while enhancaed ApoD expression is responsible for the E-3M2H secretion. To this end, we hypothesize that targeted delivery of the siRNA against ApoD would be an alternative therapy for osmidrosis. In this study, we would construct siRNA against ApoD by the following different methods ①synthesize the traditional symmetric RNAi duplexes;② synthesize the asymmetric RNAi duplexes based on our newly designed methods; ③ shRNA driven by androgen receptor. These different RNAi strategies were used to knockdown the ApoD and the functional effects on E-3M2H secretion was examined by MS quantification in an in vitro cell model. We then incorporate the shRNA or RNAi duplex into the ultrasound microbubbles to deliver these siRNA specifically the sweat gland in the axillary region by ultrasound targeted microbubble destruction (UTMD) in the monkey model, which mimics the human axillary osmidrosis faithfully. The therapeutic effects and their duration of the UTMD based drug delivery would be examined through E-3M2H quantification and the side-effects would be examined by testing the off-target effects of siRNA and the local inflammation response. Our study here would further the understanding of the pathology of axillary osmidrosis, and also provides an alternative therapeutic strategy.

腋臭严重影响患者身心健康，手术虽能够缓解患者异味，但副效应大。深入认识腋臭发病机制、探讨无创安全的治疗手段具有重要意义。课题组研究发现，在遗传和激素共同作用下，腋臭患者顶泌汗腺细胞载脂蛋白D（ApoD）表达异常增加，后者进一步引起(E)-3-甲基-2-己烯酸（E-3M2H）分泌增多，是腋臭发病的主要原因。因此，探索安全、高效、靶向降低ApoD表达的基因治疗策略有望从根本上减少E-3M2H的分泌达到治疗腋臭的目的。本项目拟利用已有构建条件性表达RNAi载体和合成低脱靶效应RNAi的研发基础，设计干涉ApoD的不同策略，并将它们分别制备成超声微泡；在此基础上，以汗腺结构与人极为相似的3岁龄恒河猴为研究对象，小动物高频超声引导下将上述超声微泡注入汗腺区，利用空泡效应将ApoD干涉序列靶向输送到汗腺细胞，观察不同RNAi策略对ApoD的靶向干涉效果及对腋臭的短期和长期疗效，为腋臭的治疗提供新的思路

腋臭严重影响患者社交活动和心理健康，已经成为一个严重的心理和社会问题。更加科学、高效、稳定的治疗腋臭具有重要的临床和社会意义。本课题围绕腋臭患者汗腺组织中高表达的ApoD是腋臭患者汗液中E-3M2H增多的重要机制，按照实验计划，探讨了靶向该分子治疗腋臭的可能性，取得如下进展：（1）明确了ApoD在腋臭患者的汗腺中高表达，是腋臭的重要发病机制。我们发现腋臭患者汗腺增大，饱满，分泌旺盛期；免疫组化检测发现ApoD在腋臭患者表达显著增加。进一步研究发现，ApoD高表达与腋臭程度密切相关。分子机制研究发现，Wnt信号增强是ApoD表达增加的重要原因之一。（2）构建了装载基因药物的脂质微泡，能够在超声引导下成功将基因药物导入体内。我们采用水浴机械震荡法，制备一种脂质微泡；荧光显微镜显示，Cy3标记的siRNA可以有效的装载进入脂质微泡。高频超声辐照后，可以有效地将基因药物导入靶组织。在此基础上，我们成功构建了靶向Wnt和ApoD的基因干涉。为了减少siRNA的脱靶效应，增强siRNA的干涉效果，课题组设计了针对β-catenin和ApoD的正义链预先剪切的siRNA序列。细胞学实验证实，上述siRNA可以高效抑制目的基因表达。（3）为了改良基因治疗手段，我们建立了靶向机体不同细胞的外泌体给药系统，为后续体内基因输送提供了备选策略。我们以外泌体中的关键蛋白Lamp2b为靶标，通过基因工程的方法，将靶向不同细胞的导向肽表达序列与Lamp2b表达序列融合，构建导向肽-Lamp2b的融合表达载体。将上述载体转染至目的细胞，收集其外泌体。体内外研究发现，该改构的外泌体，可以较好地靶向目的细胞。（4）我们分析了小鼠脚掌皮下组织的结构，发现小鼠脚掌皮下组织中存在大量汗腺组织。通过局部注射脂质体包裹的核酸和质粒，可以一定程度地递送基因药物，但效率有待进一步提高。上述研究为我们替代恒河猴找到了理想模型。（5）建立了基于CRISPR/cas9的基因编辑系统，为腋臭的基因治疗提供了新的策略。鉴于腋臭是一种基因单核苷酸多态性引起的遗传性疾病，其主要表现是局部组织的功能异常。从这个角度说，腋臭是基因编辑治疗的理想适应症。课题组改良了CRISPR/Cas9系统，设计并完成了CRISPR-Cas9+PP7-EZH2的基因沉默表观系统，通过针对ApoD启动子区设计了gRNA，体外细胞学实验验证了该系统对降低