水稻纹枯病菌T-DNA突变体库构建及其致病相关基因的分离

构建插入突变体库是发现、克隆和研究新基因的重要途径之一。AtMT遗传转化法已成功用于多个植物病原真菌。但此方法用于水稻纹枯病菌的遗传转化过程中，因启动子、抗性标记基因及转化受体的选择等因素，获得遗传稳定的突变体仍鲜有成功，导致水稻纹枯病菌这一极其重要的植物病原菌致病分子机制及相关的防治方法研究严重滞后。本实验室通过克隆水稻纹枯病菌GPD启动子，潮霉素抗性基因中增加GC含量及纹枯病菌漆酶基因内含子等手段改进转化载体的表达效率。在此项目中，拟利用已构建的具有水稻纹枯病菌特异启动子的转化载体对本实验室现有的病原真菌转化体系优化后，形成高效的水稻纹枯病菌T-DNA转化体系，并利用该方法构建水稻纹枯病菌T-DNA突变体库，进而通过接种水稻幼苗和离体叶片筛选获得致病性丧失突变体。利用TAIL-PCR、RT-PCR、RACE等技术分离相应致病相关基因，再通过基因互补等技术验证其功能。

由立枯丝核菌（Rhizoctonia Solani）引起的水稻纹枯病是世界性的水稻三大病害之一，几乎所有的稻田都会发生纹枯病，全世界平均每年因该病造成的损失稻谷达数十亿公斤。对水稻纹枯病菌的研究具有非常重要的科学和实际意义。关于水稻纹枯病菌的遗传转化，国外已有了一些报道，国内则报道甚少。对于立枯丝核菌的转化研究关报道较少，采用合适的启动子是能否进行高效转化的关键因素之一，因此寻找水稻纹枯病菌高效启动子是提高其转化效率的一种途径。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GPD）在真核细胞中高效表达，如在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）其含量可达细胞内可溶蛋白的5%；在面包酵母中其mRNA的量占总mRNA量的2~5%。因此，GPD基因的启动子可能为一强启动子。而且在许多不同的真菌中，GPD基因启动子已经被成功地用来构建转化体系。 本研究利用同源克隆及染色体步移策略，从水稻纹枯病菌基因组获得4613bp片段，NCBI序列同源分析该片段包含了GPD基因，暂命名为RsGPD，预测其全长为1531bp。通过RT-PCR扩增其CDS序列，分析显示其拥有10个内含子。Southern 杂交结果显示，RsGPD在水稻纹枯病菌基因组中以单拷贝形式存在。RsGPD编码343个氨基酸的蛋白。蛋白序列同源性分析，RsGPD基因氨基酸同源性与立枯丝核菌国际标准融合群AG-3最高，达85.52%。此外，在不同融合群的立枯丝核菌中内含子的分布及大小具有高度相似性。根据RsGPD基因设计引物，扩增水稻纹枯病菌的GPD启动子。以pCAMBIA1300X质粒为骨架，构建3个以水稻纹枯病菌GPD启启动潮霉素抗性基因的表达载体，其中2个载体的潮霉素基因做了如下改进，通过Over-lap PCR将潮霉素基因的5’端的160bp-195bp区间的AT转变为GC或在潮霉素基因两端添加水稻纹枯病菌的漆酶（Z54277）内含子。利用上述质粒，进行农杆菌介导转化水稻纹枯病菌菌丝体及菌丝球。在农杆菌介导转化水稻纹枯病菌菌丝球中，获得了转化子但转化子在继代培养中，潮霉素抗性性状出现丢失的现象，对转化体系进行了多种改进尝试，均未能解决该问题，故后续研究内容围绕水稻纹枯病菌遗传多样性及转录组测序进行。本项目实施过程中，培养硕士研究生3名；申请专利1 项，发表相关论文6篇，其中SCI 论文1 篇，均标明基金资助。