利用固定化分子簇色谱技术研究Aβ寡聚体相互作用蛋白新方法

Aβ寡聚体（oAβ）能引起神经毒性，是导致阿尔茨海默病（AD)的重要影响因素。由于目前研究方法的局限即很难控制oAβ的聚集度，研究结果均是某一oAβ范围为主、同时混有不同数量、不同oAβ混合物的作用，因此很难明确不同oAβ影响AD的分子机制。鉴于此，本研究首次提出利用固定化的分子簇，获得均一聚集度的oAβ，再通过色谱技术研究oAβ相互作用蛋白的新方法，即通过分子簇载体上活性基团的数量控制oAβ单体的数量并使其聚集；通过核酸酶将分子簇载体和Aβ间耦联的脱氧寡核苷酸切下，进行oAβ聚集情况的检测；通过控制色谱介质上活性基团的密度阻止不同oAβ发生聚集，从而获得均一聚集度的不同oAβ；再以不同oAβ为配基，通过色谱学方法吸附与分离AD相关的相互作用蛋白；通过比较不同时期的AD模型动物和不同年龄动物中oAβ作用蛋白的变化，确定AD发生发展中的关键蛋白，为进一步认识oAβ的致病机理提供依据。

Aβ是开展本研究工作的基础，为了实现定点固载，我们需要的Aβ需要氨基端额外添加一个Cys，在本基金的支持下，我们构建了新的Aβ表达载体，并通过条件优化从1升发酵液中分离纯化获得40 mg Cys-Aβ。.由于Aβ的聚集特性，Aβ经常以一系列不同分子大小的聚集体的混合物形式存在，因此很难获得某一Aβ聚集体的相互作用蛋白。在本基金的支持下，我们建立了一种通过梳状聚合物上活性基团的数量控制Aβ聚集体大小的新方法（基金申请时写的是分子簇，但后来发现用梳状聚合物更准确），再以Sepharose CL-4B为基质，通过定点反应偶联梳状聚合物配基，从而获得不同Aβ聚集体的相互作用蛋白的新方法。条件优化后，硫磺素T染色证明我们获得了不同聚集体大小的Aβ聚集体，并以不同年龄小鼠脑蛋白为研究对象，通过SDS-PAGE和双向凝胶电泳证明了不同大小的聚集体有不同的相互作用蛋白。该方法为Aβ聚集体相互作用蛋白的研究奠定了基础，相似的研究方法可以用于具有相似特性的聚集体。.Aβ聚集体中除了氢键与疏水作用，还存在共价作用，在本基金的支持下，我们比较了交联方式对通过共价作用形成聚集体的影响。结果表明光交联能在几秒内获得更多的共价交联的聚集体，并且光交联对Aβ聚集体的生理作用的影响较小，该结果为后续获得不同大小通过共价作用形成的聚集体奠定了基础。.