固定化功能蛋白质取向及构象表征和调控色谱新方法

针对固定化蛋白质色谱固定相表面蛋白质分子取向及构象尚不清楚的问题，以G-蛋白偶联受体超家族成员Beta2-肾上腺素受体（Beta2-AR）为例，以能分别特异性结合Beta2-AR全长基因、N末端和C末端结构域的3种免疫抗体为该受体的构象探针，利用其与受体结合强度与受体构象变化定量相关的特性，用前沿分析法研究离子强度、温度和pH等因素对3种抗体在Beta2-AR色谱固定相上容量因子、结合常数和热力学参数的影响，获得其与受体构象变化的定量关系，建立固定化受体取向及构象表征色谱新方法。在此基础上，以沙丁胺醇等6种配体为工具药，研究配体对固定化受体与抗体结合强度的影响及其浓度依赖关系，建立固定化受体取向及构象梳理和调控策略及方法，为功能蛋白质取向及构象的调控研究奠定基础，对以固定化功能蛋白质为核心的药物与蛋白质相互作用及药物活性成分筛选新方法具有理论意义。

本研究以G-蛋白偶联受体超家族成员Beta2-肾上腺素受体（Beta2-AR）为例，建立了基于重氮盐反应的His标签重组Beta2-AR定向固定化方法。该方法可推广至其他His标签融合蛋白质的定向固定化。项目组还引入了绿色荧光蛋白（GFP），建立了蛋白质固定化工艺及表面形态表征方法，解决了固定化功能蛋白质表面形态表征难的问题。进一步采用重氮盐方法制备了定向固定化Beta2-AR色谱固定相，建立了固定化Beta2-AR亲和色谱方法。针对经典亲和色谱中前沿分析和竞争置换分析方法的不足，推导获得了测定药物-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用的理论公式。该理论以进样量和溶质的容量因子为变量，克服了前沿分析和竞争置换分析法配体用量大和分析时间长等不足。分别采用竞争置换法和项目所得理论公式对GFP抗体与固定化GFP，三种Beta2-AR抗体与固定化Beta2-AR的相互作用，证明直接进样法所得结合常数更接近文献免疫共沉淀方法的结果。本研究还发现作用于Beta2-AR全长基因的抗体在固定化Beta2-AR色谱固定相上的保留弱于作用于N末端和C末端结构域的抗体。三种抗体中，作用于N-末端结构域的抗体在固定化Beta2-AR色谱柱上的保留最强。上述研究表明，抗体可作为构象探针，定性表征固定化功能蛋白质的构象。项目组以作用于N末端结构域的抗体为构象探针，研究了温度、离子强度和流动相pH对抗体与固定化Beta2-AR结合常数的影响，发现温度对其影响较大。最后，以麻黄碱和伪麻黄碱的混合溶液为进样溶质，分别以添加有不同浓度麻黄碱和伪麻黄碱的磷酸盐缓冲溶液为流动相，研究了不同温度及配体添加浓度对麻黄碱和伪麻黄碱在固定化Beta2-AR色谱柱上分离度的影响，证明配体和温度为影响固定化受体构象的关键因素，可用于建立固定化功能蛋白质构象调控方法。综上，本研究解决了固定化功能蛋白质构象无表征和调控方法的问题，对于以固定化蛋白质为核心的生物传感器、亲和色谱及酶联免疫试剂盒的研究具有重要意义，有望促进分析化学相关学科的发展。本项目共发表科研论文12篇，其中SCI收录7篇，研究成果被Drug Discovery Today （IF=6.890）编辑Hubertus Irth和Journal of Chromatography B（IF2.888）主编David S. Hage分别进行了重要评述。