补阳还五汤联合MSCs移植促进脑缺血损伤血管新生的分子调控机制

补阳还五汤和MSCs移植均能通过血管新生促进脑缺血损伤的组织修复，但调控血管新生的途径、靶点及作用机制不详。我们前期研究发现补阳还五汤联合MSCs移植能显著上调脑缺血损伤大鼠模型的促血管新生因子VEGF表达。本课题拟利用补阳还五汤联合MSCs移植的模型动物，采用透射电镜、分子生物学和蛋白质相关技术，研究①促血管新生作用；②血管生成抑制剂血管抑素、抗αvβ3单克隆抗体LM609及MMP抑制剂 BB94对血管新生的抑制作用；③新生血管密度变化及形态学改变；④血管新生级联事件相关因子MMP、VEGF及其受体VEGFR-1、Ang-1/Ang-2及其Tie受体和整合素αvβ3及其配体Eph-B4等的改变。从血管生成因子的合成和释放、内皮细胞表面整合素与ECM的相互作用和ECM的降解等三个方面，部分揭示补阳还五汤联合MSCs移植模型动物的促进血管新生分子调控机制，为临床应用奠定实验基础。

三年来，课题组按照申请书计划要求，开展了以下几个方面的研究工作： ①补阳还五汤联合MSCs移植的促血管新生作用；②血管生成抑制剂血管抑素、抗CD34+CD45抗体及TIMP-1对血管新生的抑制作用；③血管新生级联事件相关因子MMP、VEGF及其受体VEGFR-2、AKT、ERK、PAK和整合素αvβ3的改变等。从血管生成因子的合成和释放、内皮细胞表面整合素与ECM的相互作用和ECM的降解等三个方面，部分揭示了补阳还五汤联合MSCs移植模型动物的促进血管新生分子调控机制，主要取得了以下研究成果：.第一、体外培养大鼠骨髓MSCs第十代细胞呈集落方式生长，生长特性、细胞形态、表面标志基本保持一致， CD90＋CD106＋阳性率为95.04％，符合后续实验要求；补阳还五汤在体内、外均可诱导MSCs向神经元样细胞分化；.第二、补阳还五汤可促进模型大鼠脑缺血区MSCs的增殖；补阳还五汤联合MSCs移植可减少脑梗死体积，明显降低神经功能缺损评分，可能是通过促进血管新生，改善缺血脑组织的血液供应来实现的；或者通过上调bFGF基因表达水平，发挥对缺血再灌注损伤脑组织的保护作用；.第三、抗CD34+CD45抗体可显著减低血清αVβ3含量，MSCs能够对抗这种作用，施加中药可显著提高MSCs的作用效果；.第四、阿瓦斯汀可显著降低MACO模型大鼠血清VEGF含量，单独MSCs和联合中药的作用下，阿瓦斯汀对VEGF的抑制作用明显缓解；高浓度VEGF条件下，内皮细胞抑制素（阿瓦斯汀）可通过抑制VEGFR2及其磷酸化，降低ERK、AKT的磷酸化水平，阻止经MAPK途径的胞內信号转导途径，从而抑制内皮细胞的增殖和迁移，阻止新生血管的形成；而单独MSCs和联合中药都能够有效提高VEGFR2含量和其磷酸化水平，主要经AKT，而不是ERK，增强经MAPK途径的胞內信号转导功能，诱导内皮细胞增殖和迁移，促进血管新生；.第五、缺血脑组织中，TIMP-1与MMP-9特异性结合，形成复合物，发挥强大而持久的抑制作用，MSCs以及联合中药均不能缓解这种抑制作用。.综上所述，我们认为，补阳还五汤联合MSCs移植促进血管新生，主要是通过增加αVβ3含量，提高了VEGFR2促有丝分裂作用和其磷酸化水平，增强经MAPK途径的胞內信号转导功能，诱导内皮细胞增殖和迁移，从而促进血管新生发生的。