基于星形胶质细胞Cx43探讨补阳还五汤治疗脑缺血的分子机制

Connexin43 (Cx43) which was mainly located in astrocytes plays an important role in both damage and repairing process after cerebral ischemia. Buyang Huanwu decoction (BYHWD) is a classical prescription for treatment of cerebral ischemia in traditional Chinese medicine. Our previous studies found that BYHWD could efficiently inhibit the expression of Cx43 in astrocytes in acute stage of cerebral ischemia, but up-regulated it in reparing stage. The dual regulation of Cx43 by BYHWD is a pivotal problem in clinical treatment of cerebral ischemia. Combined with previous studies and preliminary results, we speculated as the followings: in acute stage of cerebral ischemia, BYHWD down-regulated astrocytic Cx43 by inhibition of inflammatory cytokines thus reducing infarction; In reparing stage, BYHWD enhanced Cx43 in astrocytes via bFGF so promoting nerve repairment and angiogenesis. This study intends to investigate the effect of BYHWD on Cx43 at multiple levels (gene, protein and function) in different periods after cerebral ischemia, explore the mechanisms of BYHWD affecting Cx43 from the level of molecular, histology and in vivo animals in both acute and reparing stage after cerebral ischemia, and clarify the roles of Cx43 in reducing ischemic injury and promoting repairment of BYHWD. Based on Cx43, this study aims to scientifically explain the unique advantage of BYHWD for treating cerebral ischemia (reserving its advantages and getting rid of its harmful effects), which provides new evidence for clinical treatment of cerebral ischemia.

Cx43主要位于星形胶质细胞，在脑缺血损伤和修复过程中起重要作用。补阳还五汤是中医药领域治疗脑缺血的经典名方，前期研究发现它在脑缺血急性期有效抑制星形胶质细胞Cx43，在修复期却有上调作用。补阳还五汤对脑缺血后Cx43的双相调节机制是临床治疗脑缺血的关键科学问题。结合文献和预实验结果，本项目推测：脑缺血急性期补阳还五汤通过抑制炎症因子的释放降低星形胶质细胞Cx43减轻损伤；修复期补阳还五汤通过bFGF增强星形胶质细胞Cx43，促进神经修复和血管再生。本研究拟通过基因、蛋白和功能多个水平深入探讨补阳还五汤在脑缺血不同时期对Cx43的影响，从分子、组织和在体实验探讨补阳还五汤在脑缺血急性期和修复期调节Cx43的机制，并阐明Cx43在补阳还五汤减轻脑缺血损伤和促进修复中的作用机理。本研究以Cx43为切入点，旨在科学阐述补阳还五汤治疗脑缺血的独特优势（趋其利避其害），为临床治疗脑缺血提供新的思路。

脑缺血的高发病率、高死亡率和高致残率，对国民健康造成了很大的威胁。大量实验证明星形胶质细胞Cx43在脑缺血损伤和修复过程中起重要作用。补阳还五汤是中医药领域治疗脑缺血的经典名方，但Cx43是否参与其中尚不明确。在该项目的资助下，我们发现：（1）脑缺血急性期，补阳还五汤下调Cx43的表达，联合使用NF-κB激动剂PMA后补阳还五汤对Cx43的下调作用被抑制，HE染色显示细胞受损加重；使用缝隙连接激动剂GAP-134后补阳还五汤对NO的下调作用和对SOD的上调作用均被抑制，提示补阳还五汤通过Cx43减轻脑缺血损伤。（2）脑缺血亚急性期，总Cx43和p-Cx43的表达水平逐渐升高，7天时达高峰。与缺血组相比，Gap26加重神经功能损伤减少树突棘数量，而GAP-134明显改善神经行为增加树突棘的数量。另外，Gap26会进一步破坏突触结构伴随着突触素（SYN）和生长相关蛋白43（GAP-43）的下调，而GAP-134减轻突触破坏、上调SYN和GAP-43的表达。这些结果提示Cx43可增强脑缺血后的突触可塑性。（3）脑缺血亚急性期，补阳还五汤可提高总Cx43和p-Cx43的表达水平，7天达到高峰；补阳还五汤对神经功能的保护作用以及树突棘密度和突触可塑性相关蛋白SYN和GAP-43的上调作用均被Gap26抑制；另外，补阳还五汤可增加微血管密度（MVD），上调（血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成诱导蛋白-1（Ang-1）以及改善血脑屏障通透性，而Gap26可抑制补阳还五汤的这些作用，这些结果提示Cx43参与介导补阳还五汤在脑缺血亚急性期对修复的促进作用（包括突触可塑性和血管生成）。（4）脑缺血亚急性期，补阳还五汤上调bFGF；联合使用bFGF中和抗体后补阳还五汤对Cx43表达的上调作用被抑制，而直接应用bFGF后Cx43表达增加。另外，Gap26可抑制bFGF对SYN和GAP-43的上调作用。同时，免疫荧光双染表明bFGF受体FGFR1主要表达于星形胶质细胞，补阳还五汤可上调FGFR1的表达。这些结果提示脑缺血亚急性期补阳还五汤通过bFGF上调Cx43。该项目的这些结果有利于明确补阳还五汤在脑缺血发展不同阶段发挥不同调节作用的特点，为临床上应用补阳还五汤治疗脑缺血提供更有价值的实验依据。