耐酸性苹果酸乳酸酶的定向进化与酵母表面展示

乳酸菌在引发苹乳发酵时由于不适应果酒环境而造成发酵迟缓，产生生物胺、氨基甲酸乙酯等有害物质，也常因发酵终止不彻底而造成生物病害。针对该问题，可向果酒中添加苹乳酶以转化苹果酸，但因苹乳酶不耐酸而导致转化效率低；也可用细胞融合或基因工程构建降酸酿酒酵母，但用细胞融合不能成功构建降酸酿酒酵母，基因工程方法构建的降酸酿酒酵母也因存在苹果酸的运输屏障而导致转化效率低。为了更好地解决该问题，本项目在构建酵母表面展示载体和高通量筛选产耐酸性苹乳酶酵母方法的基础上，通过定向进化和酵母表面展示对苹乳酶进行耐酸性进化和酵母表面展示，通过筛选和鉴定获得可高效降酸的酿酒酵母；比较研究耐酸性苹乳酶的酶学性质和降酸酵母发酵性能；初步研究苹乳酶耐酸机理，考察降酸酵母的质粒稳定性。展示有耐酸性苹乳酶的降酸酿酒酵母的获得将有助于缩短果酒发酵周期、提高果酒安全性、减少生物病害的发生，极大地提高苹果酸的转化效率。

为了解决因乳酸菌引发苹果酸乳酸发酵（苹乳发酵）而存在的发酵迟缓，产生生物胺等问题，本研究在成功构建酵母表面展示载体pADH1-AGG，并将苹果酸乳酸酶（苹乳酶）展示在酵母细胞表面。阳性转化子可催化苹果酸生成488.6 mg/L L-乳酸，苹果酸的转化率为21.11%。建立克隆突变基因的分泌型大肠杆菌表达系统，其最佳产MLE 条件为0.6 mmol/L IPTG， 28℃ 诱导3h，培养基初始pH为5.9。建立了吩嗪二甲酯硫酸盐-硝基四氮唑蓝（PMS-NBT）筛选产苹乳酶的方法， 最佳条件为1.5 g/L PMS，0.4 g/L NBT，0.4 mol/L Tris-HCl。其检测灵敏度为0.1g/L乳酸，且其与苹果酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、草酸无交叉反应。第一轮筛选耐酸酶的pH 为 3.5。.mle经随机突变后构建含10000个转化子的库。用PMS-NBT对突变库进行耐酸性MLE筛选，获得含耐酸MLE的菌株。将耐酸酶编码序列插入pADH1-AGG后转化酵母细胞，构建耐酸MLE的展示系统。与野生菌相比，突变子MR1的显微和超显微形态无改变，免疫学检测显示细胞表面有绿色荧光。.MR1 被培养36h后，其生物量和产酶量最大。耐酸性MLE需2.0mmol/L NAD+、5mmol/L Mn2+才发挥其活性，其Topt 为30℃，Tm值为45℃，最适pH为4.2，pH值在3-6时MLE能维持较高酶活。Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+对MLE有激活作用，而K+、Ca2+、Na+对其有抑制作用。.用MR1 和野生酵母酿制葡萄酒，MR1的发酵特性和野生酵母相差不大。苹果酸的转化率为97.1%。MR1酿制新酒的理化指标和感官指标符合国标要求，且新酒无酸涩感，口感圆润。