果酒发酵过程中酿酒酵母抑制葡萄汁有孢汉逊酵母的分子机制研究

The poor flavor and quality homogenization of wine fermented with pure culture of Saccharomyces cerevisiae inhibited the development wine industry. This problem could be improved through mixed fermentation with Hanseniaspora uvarum and Saccharomyces cerevisiae. However, the H. uvarum couldn’t play its role during mixed wine fermentation for its growth inhibition from S.cerevisiae. If the molecular mechanism of inhibition to H. uvarum from S. cerevisiae be known, we can know how to relieve the inhibition of S.cerevisiae. According to the different inhibitory activity of S.cerevisiae to H. uvarum in isolation fermentation devices with different membrane aperture, the RNA-Seq and the iTRAQ will be used to analyze the difference on the transcription level and protein level of S.cerevisiae with different inhibitory activity. Then, the deletion mutants of key genes and their complementary strains of S.cerevisiae will be constructed. The effects of mutant on the yeast growth, the antimicrobial peptides producing, the wine fermentation and the wine quality will be analyzed. The inhibition mechanism of S. cerevisiae to H. uvarum during wine fermentation will be revealed globally. The results will provide references for controlling the inhibition of S. cerevisiae to H. uvarum even other strains during wine mixed fermentation.

果酒风味单一、品质同质化阻碍了果酒行业发展，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，SC）纯种发酵是主因，葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum，HU）与SC混合发酵是解决该问题的途径之一。但混合发酵时, SC抑制HU生长而导致后者无法发挥作用。研究揭示SC抑制HU的分子机制，则可实现SC对HU抑制的调控。鉴于此，本课题通过RNA-seq和iTRAQ分析不同孔径隔离膜中，抑制活性不同的SC在转录水平和蛋白水平的差异，识别关键基因；构建SC关键基因缺失株和回补株，并分析SC突变株与HU混合发酵时对酵母生长、抗菌肽产生、果酒发酵和果酒风味品质的影响，进而从全局揭示SC抑制HU的分子机制。研究结果为解除SC对HU乃至其它菌株的抑制研究提供借鉴意义。

果酒风味单一、品质同质化影响果酒行业发展，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae, SC）纯种发酵是主因。选育的葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum, HU）与SC混合发酵是解决该问题的途径之一，但SC与HU混合发酵时HU的生长受到抑制。混合发酵中酵母间存在复杂的相互作用，但其分子机制尚不清楚，这无疑影响了HU等非酿酒酵母在葡萄酒风味品质改善中的应用。鉴于此，项目在探究SC和HU混合发酵葡萄酒的特性，建立二者隔离混合发酵（Divisible mixed fermentation, DMF）装置的基础上，分别采用转录组测序技术（RNA-seq）、串联质谱标记技术（Tandem mass tags，TMT），以及二者联合分析方法从基因的转录和翻译水平探究SC和HU的互作分子机制。同时，探究添加非酿酒酵母的粗酶提取物或纯酶在提高葡萄酒风味品质的可行性，解决因菌株生长抑制而来带的问题。结果显示：SC和HU混合发酵可提高葡萄酒果香、花香和口感，但存在生长抑制问题；采用模拟葡萄汁，80%装液量、106 CFU/mL接种量，HU置于1000 kDa透析袋外，厌氧培养可取得最佳的SC和HU的隔离和抑制效果，且DMF 24 h（T1）和72 h（T2）为最佳取样点。SC在铁转运、硫代谢和部分氨基酸转运方面无优势，但在氧化应激和修复，铜和烟酸吸收，己糖转运，糖原合成，糖有氧发酵，蛋白质分选转运和GPI修饰，乙醇利用，麦角固醇合成、孢子形成和全局调控因子VEL1等方面优与HU，尤其是在T2时刻，是造成HU被抑制的主要原因。同时建立了多种利用多株非酿酒酵母的β-葡萄糖苷酶粗提物或其纯酶来提升葡萄酒风味品质的方法，所得葡萄酒理化指标符合GB/T 15037-2006对干红葡萄酒的要求，且花香、果香和口感得到提升，草本味减弱。研究结果为选育可改善葡萄酒风味品质的HU等非酿酒酵母的菌株选育提供借鉴，也为微生物间的互作研究奠定了理论基础。