协同调控关键酶及代谢前体物提高酿酒酵母异戊二烯生物合成效率的研究

The development of the isoprene rubber industry in China is severely hindered by the shortage of its monomer, isoprene. The traditional isoprene production requires petroleum-based C5 chemicals as the main material, the supply of which is however continuously decreasing due to the employment of new technologies in the petrochemical industry. Therefore, there is an urgent need for new isoprene production technology. This project utilizes Saccharomyces cerevisiae as the chassis organism and engineers it for efficient production of isoprene, which is the important monomer for synthetic rubber. Targeting at the two bottlenecks in isoprene biosynthesis, including the weak competitiveness of the isoprene synthesis branch and the low utilization efficiency of the precursor, this project proposes a co-engineering strategy of the key enzyme and precursor supply. First, in order to increase the competitiveness of the isoprene synthesis branch, a directed evolution method is developed for the isoprene synthase by combining metabolic engineering. In more details, high-throughput screening methods are established using the product of the competing pathway (lycopene) or the cytotoxicity of the accumulated intermediate (DMAPP) as the indicators. And then the two subcellular compartments, cytoplasm and mitochondria, are co-regulated to enhance the comprehensive utilization efficiency of the precursor acetyl-CoA. This work will provide methodological reference for the in vivo engineering of enzymes, and meanwhile lay a foundation for the bioproduction of bulk chemicals, and is therefore of great importance for the sustainable development of the petrochemical industry in China.

我国异戊橡胶产业的发展受到了其聚合单体—异戊二烯来源不足的严重制约。传统的异戊二烯生产工艺主要以石油基C5裂解物为原料，随着石化行业新工艺的发展，C5裂解物的来源不断减少，因此迫切需要开发新的异戊二烯生产工艺。本项目拟以酿酒酵母为底盘生物，高效合成异戊二烯。针对异戊二烯生物合成中存在的两大瓶颈问题，即异戊二烯合成支路竞争力弱以及前体物利用率低，拟采用协同调控关键酶活性和前体物供应的策略，首先结合代谢工程建立异戊二烯合成酶的定向改造技术，通过竞争途径番茄红素的颜色指示和中间代谢产物的毒性抑制建立高通量筛选方法，提高异戊二烯合成支路的竞争力，然后，通过对细胞质和线粒体两大细胞空间区域进行代谢调控，提高前体物乙酰辅酶A的综合利用率。该项工作将为体内酶分子改造提供方法借鉴，具有广泛的通用性，同时将为利用生物技术制备大宗化学品奠定良好的理论及方法基础，对推动我国石油化工行业的可持续发展具有重大意义。

异戊二烯是合成橡胶的重要单体，同时也是医药、香料和农药等领域的重要原料。生物法合成异戊二烯具有环境友好、条件温和、原料可再生等优势。本研究以酿酒酵母为底盘，结合蛋白质工程、代谢工程等手段，从代谢前体物供应与转化调控以及异戊二烯合成酶改造等两个方面探讨异戊二烯生物合成的综合调控策略，以提高酿酒酵母合成异戊二烯的能力。. 本研究首先通过定向进化手段，利用焦磷酸物质过度积累导致细胞毒性的特点，开发高通量的筛选方法对异戊二烯合酶进行定向改造，并进一步通过定点饱和突变获得阳性突变体，与野生型相比，催化效率提高了近3倍。为了增强异戊二烯合成前体的供应，将整条合成途径定位到线粒体中，进一步提高了酿酒酵母合成异戊二烯的能力，产量达到克级水平。. 在异戊二烯合成途径中，关键节点IPP/DMAPP的代谢平衡对目标产物的合成起着重要影响，因此，分别通过在线粒体中构建异戊二烯合成途径以及细胞质推-拉-阻调控来增强异戊二烯合成前体的供应，并在细胞质改造菌株和线粒体改造菌株中基于生物量和副产物积累情况的变化来调控关键节点基因MVD1和IDI1的表达量，从而重建异戊二烯合成途径上下游之间的代谢平衡。最终通过单倍体杂交构建线粒体-细胞质双重调控菌株，其异戊二烯产量达到11.9g/L。. 线粒体和细胞质异戊二烯生物合成途径中的共同前体物为细胞质中的丙酮酸，因此丙酮酸向线粒体的转运情况影响着这两个细胞区室中的碳源分配。过表达丙酮酸转运蛋白后异戊二烯产量下降，而下调丙酮酸转运则将异戊二烯产量提高了20%，说明与细胞质途径相比，线粒体的合成途径相对较弱。最终，完全敲除丙酮酸线粒体转运蛋白MPC3的线粒体-细胞质双调控菌株异戊二烯产量可达14.3g/L，这是目前报道的真核生物中最高的产量。. 本研究通过协同调控关键酶以及代谢前体物提高了酿酒酵母的异戊二烯合成效率，为生物法合成异戊二烯的工业化奠定了基础，并为其他萜烯类产物的生物合成提供了参考。