极端嗜盐古菌乙酰-CoA羧化酶在PHBV合成过程中的作用

古菌是一类极其重要的微生物资源，本实验室已自主完成了一株极端嗜盐古菌- - -极端富饶盐杆菌的全基因组测序，此菌在特定条件下能够高效积累PHBV (聚羟基丁酸戊酸酯)。初步研究已发现，乙酰-CoA羧化酶α亚基编码基因的破坏对PHBV 的合成具有明显的影响，而细菌中未见此类报道。本项目拟以极端富饶盐杆菌的乙酰-CoA羧化酶为研究对象系统展开，通过综合运用多种生物学方法和检测手段，研究乙酰-CoA羧化酶全酶的亚基组成，解析此酶对PHBV产量及聚合物单体比例的影响，从而进一步明确乙酰-CoA羧化酶在极端嗜盐古菌中的生理生化功能，初步探索乙酰-CoA羧化酶在极端富饶盐杆菌PHBV合成过程中的作用机制。此研究不仅可以揭示古菌不同于细菌的PHAs（聚羟基脂肪酸酯）合成途径，而且为乙酰-CoA羧化酶在基因工程方面的应用奠定了一定的理论基础。

本项目以高效积累PHBV的极端富饶盐杆菌为研究对象，围绕酰基-CoA羧化酶（包括乙酰-CoA 和丙酰-CoA羧化酶 ACC/PCC）系统展开，阐明了羧化酶的亚基组成、该酶缺失对菌体代谢产生的全局影响及可能的作用机制，取得了下述预期成果。基于全基因组已经完成测序的富盐菌，对其可能的ACC/PCC编码基因进行了生物信息学预测和分析。随后，构建了多个相关基因的敲除株或者部分破坏菌株，并对野生菌和突变株的全细胞蛋白进行ACC/PCC酶活测定，发现该菌的PCC活性要远高于ACC活性，明确了PCC的亚基组成。当以丙酸为唯一碳源时，野生菌生长良好，而ΔpccBE是不能够生长的，也说明了pccBE是PCC的重要编码基因。pccBE基因的敲除全面影响了菌体的代谢。初级代谢层面表现在细胞形态由规则的圆球状变为表面不规则的凹凸状，对数期的生长速度减慢、葡萄糖的利用能力减弱等。次级代谢层面主要表现在急剧降低了PHBV的积累能力，如PHBV的产量可降至野生菌的14%，3HV单体比例由10 mol%升高到64 mol%。HPLC-MS/MS检测到ΔpccBE突变株胞内的丙酰-CoA 的浓度是野生菌的几十倍。通过体外添加丙酰-CoA，发现高浓度的丙酰-CoA抑制了TCA循环中的琥珀酰-CoA合成酶。最后，在转录组学水平上阐述了pccBE的敲除引起菌体的一些变化，发现突变株中丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因簇在转录水平上大幅度下调，PHA合成基因簇的转录也明显下调，与应激相关的很多基因明显上调。根据以上实验结果，得出PCC影响菌体代谢的可能机制：PCC负责丙酰-CoA到琥珀酸-CoA的转化，PCC活性的丧失使胞内积累过高浓度的丙酰-CoA，从而抑制了TCA循环中琥珀酰-CoA合成酶的活性，反馈抑制了中心代谢途径的关键酶丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因的下调表达，这些都会减缓菌体的生长和对葡萄糖的利用，减少乙酰-CoA和还原力的生成，进而降低了PHBV的合成能力；同时，菌体也通过上调很多应激蛋白的转录水平以启动针相应的应激策略，从而应对由于PCC缺失造成的代谢紊乱。