莪术醇单链抗体（scFv)诱导广西莪术提高莪术醇含量的研究

我们最近的研究发现，往植物中转入针对其生物活性成分的单链抗体（scFv）基因，可以诱导其产生更多的该成分。莪术醇是广西莪术中主要抗癌活性成分，在广西莪术中含量低。研究如何提高广西莪术植物中莪术醇的含量，是十分有必要的。我们因而拟尝试往广西莪术细胞中转入抗莪术醇单链抗体基因，以提高其莪术醇含量。首先制备分泌抗莪术醇单克隆抗体的杂交瘤细胞系，从中提取mRNA，扩增抗体可变区，构建scFv基因，考察在大肠杆菌中的表达后，通过农杆菌介导或其它方法转入广西莪术细胞，比较表达抗莪术醇scFv基因后的植物材料中莪术醇含量与野生型的差异。若能如期提高其含量，今后可在此基础上进而培育广西莪术优质品种，为莪术醇的开发提供资源保障，也可为扩大药用植物资源提供示范。通过转入抗莪术醇单链抗体基因提高广西莪术植物中莪术醇含量的研究，在国际上尚属首创。

本项目以广西道地药材广西莪术（Curcuma kwangsinensis S.G..Lee et C.F.Liang）为研究对象，针对其挥发油中的抗肿瘤活性化合物莪术醇（Curcumol），进行了单克隆抗体（mAb）制备及单链抗体（scFv）基因构建的研究。在细菌中表达、纯化并复性了scFv蛋白。进一步利用慢病毒表达系统在小鼠骨髓瘤细胞SP2中表达了scFv基因。尝试了鉴定莪术醇相互作用蛋白的研究工作，以期揭示莪术醇抗肿瘤的作用靶点及机理。主要结果如下。.1、以DMAP做催化剂，莪术醇与丁二酸酐为反应物得到的莪术醇丁二酸单酯半抗原，再行EDC法与载体蛋白偶联合成的莪术醇完全抗原，具有很好的免疫原性，可作为免疫原应用于抗莪术醇mAb的制备。该合成方法反应条件温和、质量稳定，产率为87%。.2、应用杂交瘤技术制备出了能够高度分泌抗莪术醇mAb的细胞株，经腹水制备、ProteinG琼脂糖凝胶亲和色谱柱纯化，可得到含量在90%以上的抗莪术醇的mAb。对抗体进行特征鉴定与评价，显示抗体的效价高，亲和性好，特异性强。.3、初步建立了莪术醇ELISA分析方法，并进行了方法学考察，显示该方法的线性、重现性（9.02%）、精密度（＜9%）、加样回收率（10.01%）、板间（＜10%）板内（＜10%）差异程度符合免疫分析要求，最低检测限为78ng.ml-1。以该法测定广西莪术、温莪术、含莪术醇的生物样本，其检测结果与气相色谱分析结果无显著差异。.4、克隆到了抗莪术醇mAb轻链和重链基因。通过重叠延伸拼接的方法构建了抗莪术醇单链抗体（scFv）基因，并将scFv基因克隆在细菌表达载体pET21a中。scFv基因可以在细菌中高效表达，但形成了包涵体。进一步利用Ni-NTA树脂纯化scFv蛋白，在复性缓冲液中透析复性scFv，得到可溶性蛋白。.5、在小鼠骨髓瘤细胞SP2中成功地表达了C端带有Flag标签的抗莪术醇scFv蛋白。此外尝试了鉴定莪术醇相互作用蛋白研究，建立了初步的实验路线与方法。.研究结果为广西莪术资源开发及品质研究奠定了一定的基础，同时也建立了抗体基因工程的基本平台和技术。