p32在调控PKCzeta活性和乳腺癌细胞趋化运动的作用机制研究

转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因，趋化运动在肿瘤转移中起着重要作用，PKCzeta是乳腺癌细胞趋化运动信号途径中的关键分子。目前关于趋化运动过程中调控PKCzeta活性的详细机制并不清楚，申请人在乳腺癌细胞中发现p32是PKCzeta的一个结合蛋白质，采用小RNA干扰技术降低乳腺癌细胞中p32的表达后可以明显抑制EGF诱导的趋化运动，同时p32表达下调导致乳腺癌细胞对EGF诱导的F-actin聚合能力也明显降低，初步证实p32参与了EGF诱导的乳腺癌细胞趋化运动。本研究拟在前期研究基础上进一步阐明p32与PKCzeta?的结合位点，明确p32在调节PKCzeta活性、乳腺癌细胞迁移能力、对细胞外基质的粘附能力和细胞骨架重构中的详细作用；同时在免疫缺陷小鼠乳腺癌转移模型中验证p32表达下调对乳腺癌细胞转移能力的影响。该研究对于进一步揭示肿瘤细胞趋化运动和转移发生的分子机制具有重要意义。

p32又名C1QBP、HABP1或gC1qR。大量研究发现p32在多种肿瘤组织中高表达，而且与患者预后不良明显相关，但是分子机制不明。前期研究发现p32是介导癌细胞趋化运动的关键分子PKCzeta的一个结合蛋白质，本次研究中我们探讨了二者相互作用在调节乳腺癌细胞趋化运动中的作用机制，获得了如下研究成果：采用western blotting的方法发现p32在高转移的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT549中高表达，而在低转移的T47D、Bcap37和永生化的乳腺上皮细胞HBL100中低表达，随后免疫组化的结果显示p32在浸润性导管癌组织中的表达明显高于乳腺增生组织，而且其高表达与肿瘤的TNM分期和患者发生远处转移密切相关，说明p32可能是肿瘤转移或患者预后不良的一个指标。采用RNAi技术降低p32的表达可以明显抑制EGF诱导的趋化运动和划痕诱导的细胞迁移能力；p32表达下降还抑制EGF诱导的F-actin聚合能力、粘附能力和cofilin的磷酸化水平；同时p32表达下调还抑制细胞极化和GSK3beta的磷酸化；证实p32是EGF诱导的乳腺癌细胞趋化运动中关键分子。免疫荧光染色发现EGF可以诱导p32和PKCzeta由胞质向胞膜发生转位，而且两者之间存在共定位；反向免疫沉淀实验证实PKCzeta的调节结构域与p32的74-174aa结构域存在相互作用。降低p32的表达抑制了EGF诱导的PKCzeta的磷酸化和向细胞膜转位，但是降低PKCzeta的表达并不影响EGF诱导p32的膜转位，提示p32位于PKCzeta的上游。采用氧化磷酸化的抑制剂Rotenone并不抑制EGF诱导的细胞迁移和趋化运动以及PKCzeta的激活，说明p32调节PKCzeta激活以及细胞迁移和趋化运动并不依赖于其调节细胞氧化磷酸化的功能。最后对免疫缺陷小鼠乳腺癌转移模型的研究发现p32表达下调明显抑制了乳腺癌细胞肺转移的发生。此外，我们继续采用免疫共沉淀结合质谱的方法发现了NPM1也是PKCzeta的结合蛋白，而且NPM1在结肠癌细胞和组织中高表达，并与癌细胞的侵袭能力增强明显相关；目前关于NPM1与PKCzeta的相互作用模式以及在癌细胞转移中的作用正在深入研究中。综上所述，经过三年多的研究，我们证实了p32介导了PKCzeta的激活并在乳腺癌细胞迁移、趋化运动和转移过程中起非常重作用。