大豆凝集素对猪小肠上皮整联蛋白介导细胞增殖与凋亡机制的研究

Soybean agglutinin is one of the important soybean anti-nutritional factors, which has anti-nutritional effects on animals by specific binding with intestinal epithelial glycosylation site. Integrin-mediated cell adhesion to extracellular matrix components is the precondition of integrin-mediated biological functions. They are glycoprotein receptors on the cell membrane and may mediate cellular biological functions such as cell proliferation and apoptosis by combining with soybean agglutinin. In addition, SBA may also have ligation with some other proliferation and apoptosis related proteins, which induce the change of cell proliferation. Therefore, in this project, we use intestinal epithelial cell from piglets as experimental model and soybean agglutinin as excitor substance to research the effect of soybean agglutinin on integrin and some realted ptorein-mediated cell proliferation and apoptosis mechanism of intestinal epithelial cell from piglets. We preliminary explore types of integrin subunits and its connection with soybean agglutinin in intestinal epithelial cell using SDS-PAGE combined with mass spectrometry; detect the effect of soybean agglutinin on cell cycle, cell proliferation and apoptosis using flow cytometry (FCM) instrument; meanwhile reveal the regulation function of soybean agglutinin on integrin subunits and related proteins expression and mRNA expression by FCM and fluorescence quantitative PCR detection techniques. In conclusion, we discuss the roles of integrin and related proteins in soybean agglutinin mediated cell proliferation and apoptosis changes, which lay the foundation for further reveal anti-nutritional process and mechanism of soybean agglutinin.

大豆凝集素是大豆抗营养因子中重要的一种，通过与肠道上皮糖基位点特异性结合，对机体产生抗营养作用。整联蛋白介导的细胞粘附作用是指导细胞生物学功能的前提，且整联蛋白是细胞膜上的糖蛋白受体，可能与大豆凝集素通过结合作用介导细胞增殖与凋亡等生物学功能。除此之外，大豆凝集素可能还会与其他细胞增殖凋亡相关蛋白发生作用关系，引起细胞增殖改变。因此，本项目以仔猪小肠上皮细胞为模型，用纯化的大豆凝集素处理细胞，研究大豆凝集素对仔猪小肠上皮由整联蛋白及其相关蛋白介导的细胞增殖与凋亡机制的影响。采用凝胶电泳和质谱结合的方法初步探索猪小肠上皮中整联蛋白亚基的种类及与大豆凝集素的连接方式；流式细胞仪检测大豆凝集素对细胞周期，细胞增殖和凋亡的影响；同时采用流式细胞仪和荧光定量PCR等检测技术，揭示大豆凝集素对肠道上皮细胞整联蛋白及相关蛋白表达量及mRNA表达量的调节作用，探讨整联蛋白及其相关蛋白在大豆凝集素引起细胞增殖和凋亡改变中的作用，为进一步揭示大豆凝集素的抗营养过程和机制奠定基础。

大豆凝集素（SBA）是大豆及大豆产品中含有的抗营养物质，这种物质可通过与肠道上皮细胞膜表面特异性结合，改变细胞的结构及功能，影响肠上皮细胞的代谢过程。整联蛋白是细胞膜上的跨膜糖蛋白，其介导的细胞粘附作用是指导细胞生物学功能的一个重要因素。为了阐明SBA在影响猪肠道上皮细胞健康过程中是否与整联蛋白的信号传递存在关系，本项目主要开展了以下三部分试验研究。本项目以仔猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）为细胞模型，探究表达于IPEC-J2细胞中整联蛋白亚基的种类，探索这些整联蛋白亚基的在IPEC-J2细胞增殖，周期，凋亡以及SBA引起的IPEC-J2细胞周期及凋亡改变中的作用，初步研究SBA与这些整联蛋白之间的作用关系及连接方式。试验结果显示特异性分布于IPEC-J2细胞膜蛋白上的整联蛋白亚基种类为5种，分别为α2，α3，α6，β1和β4。不同水平的SBA会通过阻滞IPEC-J2细胞周期于G0/G1期而显著降低细胞增殖（P<0.05），引起细胞凋亡（P<0.05）。SBA会显著下调细胞周期关键基因CDK4，Cyclin E和Cyclin D1的mRNA表达水平。整联蛋白α2，α3，α6，β1和β4是维持IPEC-J2细胞正常增殖，周期及凋亡的重要蛋白，功能性抑制任何一种亚基均会引起细胞周期阻滞于G0/G1期（P<0.05），抑制IPEC-J2细胞增殖（P<0.05），促进细胞凋亡（P<0.05）。且整联蛋白α2，α6和β1参与SBA引起的IPEC-J2细胞周期改变过程（P<0.05），而整联蛋白α2，α3，α6，β1及β4参与SBA引起的IPEC-J2细胞凋亡过程。除此之外，SBA与整联蛋白之间没有直接的连接关系，SBA可通过与ACTN2结合间接引起整联蛋白基因表达量及功能的改变，进而影响IPEC-J2细胞增殖，周期及凋亡等生命活动。以上研究结果为从更深层次上揭示了SBA的抗营养机制，同时整联蛋白也可为如何改善SBA引起肠道增殖抑制和凋亡等领域的研究提供一条重要的研究思路。