孕妇外周血胎儿DNA的生物学特征用于无创产前诊断的研究

The implement of national universal two-child policy makes urgent requirements for ensuring the quality of the new born and popularizing clinic non-invasive prenatal testing (NIPT) of birth defect in all levels of hospitals. Application of NIPT of the majority of abnormal pregnancies is restricted by the lack of specific diagnostic markers. Preeclampsia is one of the main causes of morbidity and death of both pregnant women and fetus, which has no specific screening marker found for early forecast yet. Illuminating the biological properties of cell-free fetal DNA (cffDNA) in maternal plasma is the prerequisite for developing more accurate, rapid and low-cost strategy for NIPT. CffDNA fragments are shorter than maternal circulating DNA. Based on the previous evidence of the characteristic differences in the cffDNA length distribution and sequence signature between healthy and chromosomal aneuploidy pregnant women, applicant proposes to explore the existing principles of cffDNA in maternal plasma with the pointcut of length distribution and sequence signature, taking advantage of high-throughput sequencing technology. This project sheds light on the cffDNA length distribution and sequence signature in different physiological states, screens and verifies specific early molecular markers of cffDNA biological properties in preeclampsia women plasma, and finally establishes simpler, more accurate and low-cost novel approach for early NIPT of preeclampsia, which can be implemented by traditional molecular biological tools.

国家全面二孩政策的实施对保障出生人口质量，推广和完善各级医院出生缺陷临床无创产前诊断（NIPT）提出了迫切需求。多数异常妊娠疾病缺乏特异性诊断标志物，限制了NIPT的应用。妊高症是全球孕妇和胎儿发病和死亡的主要诱因之一，尚无早期预测的特异性检测标志物。探明孕妇外周血胎儿游离DNA（cffDNA）的生物学特征是发展更精确、快速和低成本NIPT的必要前提。cffDNA片段较母体源循环DNA短。申请人基于前期研究发现cffDNA的片段长度分布和序列特征在健康孕妇和胎儿非整倍体孕妇中存在特征性差异的结果，提出以长度分布和序列特征为切入点，利用高通量测序技术，探明孕妇血浆cffDNA的存在规律，揭示不同基础生理状态下cffDNA的长度分布及序列特征，筛选并验证妊高症孕妇外周血cffDNA生物学特征特异的早期筛查分子，建立利用传统分子生物学手段实现的，更简单、精确和低成本的妊高症早期NIPT新方法。

国家全面三孩政策的实施和逐年增高的晚育女性比例，对保障出生人口质量，推广和完善各级医院出生前临床监控提出了迫切的需求。目前无创产前诊断(NIPT)的临床应用仅限于胎儿染色体异常，且依赖高通量测序平台，限制了异常妊娠疾病临床筛查的推广和普及。本项目基于测序发现的孕妇血浆胎儿cfDNA较母体cfDNA长度短，进一步探究了cfDNA的生物学特征，使其成为可利用传统分子生物学方法对这些特征实现快速、精确的NIPT的分子生物学指标。本项目完成的主要研究内容：阐明孕妇血浆cfDNA的长度特征，揭示健康孕妇和妊高症患者血浆cfDNA生物学特征的特异性差异；通过与孕妇血浆cfDNA提取后扩增结果进行比较，建立了利用直接PCR扩增技术进行孕妇血浆细胞外囊泡evcfDNA(evcfDNA)完整性的快速检测方法；探明了卵泡液和胚胎培养液cfDI与后期卵裂胚和囊胚质量的关联。重要结果和关键数据包括：孕妇血浆cfDNA长片段浓度随孕周增加而升高，妊高症患者血浆cfDNA完整性(cfDI)较健康孕妇明显升高，揭示了在不同基础生理状态下的长度分布规律，并提示孕妇血浆cfDI可作为潜在的早期筛查妊高症等异常妊娠的分子生物学指标。血浆evcfDI随孕妇年龄和BMI的增加显著降低，说明孕妇临床生理学状态是一种创新的可用于校准evcfDI数值的因素。孕妇生理状态与evcffDNA比例关系的结果进一步表明，更高比例的短片段是来源于胎盘释放的evcffDNA，而导致高BMI和年龄组evcfDI下降的主要原因是母体来源的evcfDNA的片段化。此外，非整倍体胎儿evcfDI从2.113显著下降至0.681，说明evcfDI可能成为非整倍体胎儿NIPT的潜在生物标志物。优化体系的血浆样本可进行定量PCR直扩，并验证了血浆直接扩增分析微量样本孕妇血浆cfDNA片段化程度的准确性，为后期研究微量样本中含量较低的cfDNA提供了关键的实验方法。胎儿胚胎阶段cfDNA的研究发现，欠缺发育为高质量级别卵裂胚潜能的卵细胞的微环境cfDI更高，卵子微环境的cfDI具有在早期评估后期卵裂胚和囊胚质量级别的潜力；ROC曲线显示预测卵裂胚质量参数AUC>0.927，故卵裂胚和囊胚培养液cfDI可作为除了从形态学评估胚胎质量级别外的潜在替代评估指标。