小G蛋白Rab13调控血管内皮细胞巨自噬的作用及机理研究

Macroautophagy is an important factor affecting endothelial function, but its molecular mechanism remains unclear. We used pterostilbene, a newly identified small-molecule inducer of autophagy, to induce vascular endothelial cell autophagy and found that the small GTPase Rab13 is significantly up-regulated. Knockdown of Rab13 suppressed the pterostilbene-induced autophagy, whereas Rab13 overexpression could induce autophagy in vascular endothelial cells. We generated three Rab13 mutants and found that only expression of the constitutively active Rab13 mutant could induce autophagy in vascular endothelial cells. Accordingly, we speculated that the active form of Rab13 might be involved in the regulation of autophagy in vascular endothelial cells. In addition, co-immunoprecipitation analyses showed that Rab13 could interact with mitogen-induced gene 6 (MIG6). Based on these findings, we will further analyze the role of the active form of Rab13 in autophagy in vascular endothelial cells; validate the interaction between the active form of Rab13 and MIG6; determine whether Rab13 regulates vascular endothelial cell autophagy through MIG6 and whether a regulatory relationship exists between them; investigate the relationships between mTOR signaling and Rab13 as well as MIG6. The project will provide new experimental evidence for understanding the mechanism underlying vascular endothelial cell autophagy and provide new clues and targets for the prevention and treatment of cardiovascular diseases.

血管内皮细胞巨自噬是影响内皮功能的重要因素，但其分子机制并未搞清。本课题组利用新鉴定的小分子自噬诱导剂紫檀芪处理血管内皮细胞，发现小G蛋白Rab13上调显著。阻断Rab13抑制紫檀芪诱导的自噬，而过表达Rab13诱导血管内皮细胞自噬。我们构建了Rab13的三种突变体，发现只有表达Rab13活化突变体能够诱导血管内皮细胞自噬。据此，我们推测：活化态Rab13可能参与调控血管内皮细胞自噬。此外，免疫共沉淀结果显示，Rab13和有丝分裂原诱导基因6（MIG6）互作。在此基础上，本项目拟进一步解析活化态Rab13在血管内皮细胞自噬中的作用；验证活化态Rab13与MIG6的互作；研究Rab13是否通过MIG6调节血管内皮细胞自噬以及二者是否存在调控关系；探索Rab13和mTOR信号的关系以及MIG6在其中的作用，为阐明血管内皮细胞自噬分子机制提供新的实验证据，为心脑血管疾病的防治提供新的线索和靶点。

在前期工作中，本课题组筛选并鉴定了一种新血管内皮细胞自噬诱导剂——紫檀芪。利用紫檀芪为工具诱导血管内皮细胞自噬，高通量基因表达谱芯片检测到Rab13基因表达上调最显著。阻断Rab13抑制紫檀芪诱导的血管内皮细胞自噬；过表达Rab13则直接诱导血管内皮细胞自噬。Rab蛋白作为分子开关，在与GTP结合的活化态和与GDP结合的失活态之间互相转换。我们发现，只有转染包含活化态Rab13突变体的表达载体能够诱导血管内皮细胞自噬，说明活化态Rab13参与血管内皮细胞自噬调控。进一步研究发现上调活化态Rab13能够加强与生长因子受体结合蛋白2 (growth factor receptor bound protein 2, Grb2)的互作，激活下游腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）信号通路，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）活性，诱导血管内皮细胞自噬。该研究首次揭示了Rab13蛋白调控血管内皮细胞自噬的新角色，为阐明血管内皮细胞自噬分子机制提供新的实验证据，为心脑血管等疾病的防治提供新的线索和靶点。.此外，我们首次发现四氧化三铁纳米颗粒会导致血管内皮细胞自噬失调，引发血管功能紊乱和炎性反应，为评估纳米颗粒的安全性提供了新的实验依据。同时，我们筛选并鉴定了一种新的晚期自噬抑制剂CA-5f。不同于氯代奎宁和巴弗洛霉素A1，其对自噬流的抑制不是通过影响溶酶体的pH值或水解功能实现的，这为研究自噬小体和溶酶体结合的分子机制提供了一种新的有力工具。.在该项目的资助下，我们首次阐明了Rab13调控血管内皮细胞自噬的作用及机理。在Autophagy等自噬领域国际知名期刊上发表SCI收录论文7篇，其中1篇获得“河南省自然科学优秀学术论文一等奖”。授权国家发明专利2项。